張兆偉，秦妮娜，陳 鍇，鄒雨霞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，延安 716000)

阿片類藥物被廣泛用于緩解中重度疼痛，其中嗎啡、杜冷丁和羥考酮等鎮(zhèn)痛藥多是通過μ阿片受體介導(dǎo)[1-5]。[MePhe3，D-Pro4]morphiceptin (PL017)，是基于μ阿片受體激動劑morphiceptin(Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2)修飾所得，對μ阿片受體有較高的選擇性和親和力[6-8]。熱板實驗結(jié)果顯示，PL017在中樞水平和外周水平都表現(xiàn)出強效的劑量依賴性的鎮(zhèn)痛。PL017在中樞水平和外周水平均可顯著抑制小鼠的胃腸推進，有效緩解腹瀉癥狀，且緩解腹瀉的有效劑量遠低于它抑制胃腸推進所需的劑量，提示PL017治療腹瀉時不會造成胃腸功能紊亂[9-10]。研究表明，PL017跨血腦屏障的水平有限，因此，本實驗試圖探究PL017在外周水平對小鼠內(nèi)臟痛(經(jīng)典的外周痛醋酸扭體模型)、末端結(jié)腸(結(jié)腸排珠實驗)和排便的調(diào)節(jié)。

1 儀器與材料

1.1儀器 AR2140型電子天平(美國Adventurer公司)；DHG-9030B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海煜南儀器有限公司)。

1.2試藥 μ阿片受體激動劑PL017和μ阿片受體拮抗劑cyprodime (Tocris公司)；冰醋酸(天津永晟精細化工有限公司)。

1.3動物 雄性昆明系成年小鼠，體質(zhì)量23±1 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于嚴(yán)格控溫22±1 ℃、控光12/12 h晝夜循環(huán)的動物房，保障充足的鼠糧、飲水，并保持鼠房、鼠籠的清潔。

2 方法

2.1醋酸扭體模型 醋酸扭體模型很好地模擬了腹腔炎癥引起的腹痛癥狀，是研究外周鎮(zhèn)痛的經(jīng)典模型。參考文獻方法[11-12]，將新鮮配制的醋酸溶液(6 mL·L-1，0.2 mL)注入小鼠(6～8只·組-1)腹腔，觀察并記錄皮下注射PL017或生理鹽水15 min內(nèi)的扭體次數(shù)。

2.2結(jié)腸排珠實驗 參照文獻方法[13-14]，在小鼠皮下注射PL017或生理鹽水，于10 min后用玻璃棒輔助將預(yù)熱的玻璃珠(37 ℃，直徑3 mm)塞入小鼠(6～8只·組-1)末端結(jié)腸(深2 cm)，并迅速將小鼠單只置于鼠籠中，觀察并記錄小鼠排出玻璃珠的潛伏期。

2.3排便實驗 為避免皮下給藥時刺激小鼠的排便，選擇異氟烷吸入輕度麻醉。迅速皮下注射PL017或生理鹽水，并于10 min后將小鼠(6只·組-1)單只放在金屬網(wǎng)格為底的鼠籠中，小心收集30 min內(nèi)的糞便顆粒，置于60 ℃烘箱中過夜烘干，記錄糞便顆粒數(shù)和干質(zhì)量[15-16]。

2.4數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Origin軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析的Bonferroni法檢驗組間的顯著性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1PL017在醋酸扭體模型中的鎮(zhèn)痛作用 見表1。

表1皮下注射PL017對醋酸扭體的調(diào)節(jié)

Tab.1 Effects of subcutaneous PL017 on the acetic acid-induced writhing

分組劑量 /μg·kg-1扭體次數(shù)P動物數(shù)/只生理鹽水050.38±2.26-8PL017 347.86±2.690.487PL0171029.43±2.644.02×10-57PL017309.71±1.441.82×10-97PL017506.14±1.588.58×10-107

注：-表示與生理鹽水組不進行顯著性比較。

由表1可知，與生理鹽水組相比，皮下注射PL017(3～50 μg·kg-1)能有效地減少15 min內(nèi)醋酸模型小鼠的扭體次數(shù)。其中3 μg·kg-1組小鼠的扭體次數(shù)略低于生理鹽水組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而PL017在高劑量時(30和50 μg·kg-1)，幾乎將醋酸誘發(fā)的扭體反應(yīng)完全消除。結(jié)果表明，皮下注射PL017對醋酸誘發(fā)的炎性痛有強效鎮(zhèn)痛作用，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(ED50=9.76±1.36 μg·kg-1)。

3.2PL017鎮(zhèn)痛調(diào)節(jié)中的受體參與 參考文獻方法[17]，提前60 min腹腔注射μ阿片受體拮抗劑cyprodime(1 mg·kg-1，0.2 mL)。見表2。由表2可知，與生理鹽水組相比，cyprodime自身對醋酸誘發(fā)的扭體行為無顯著影響(48.29±2.44，P=0.54)；與只注射30 μg·kg-1PL017的小鼠相比，預(yù)注射的cyprodime卻能夠完全拮抗PL017而表現(xiàn)出與生理鹽水組相近的扭體次數(shù)(51.5±1.99，P=4.08×10-10)，表明PL017在醋酸扭體模型的鎮(zhèn)痛作用是通過激活μ阿片受體介導(dǎo)的。

3.3PL017對結(jié)腸排珠的調(diào)節(jié) 見表3。由表3可知，生理鹽水組小鼠排出玻璃珠的時間為394±33.49 s。與生理鹽水組相比，在扭體鎮(zhèn)痛ED50的10倍劑量(50 μg·kg-1)時，PL017對小鼠的排珠潛伏期無顯著的調(diào)節(jié)作用；而只有10倍于鎮(zhèn)痛ED50的100 μg·kg-1，PL017可有效延遲小鼠的排珠潛伏期(559.75±67.98 s，P=0.046)。

表2提前60min預(yù)注射μ阿片受體拮抗劑cyprodime對PL017鎮(zhèn)痛的影響

Tab.2 The influence of 60 min pre-treated μ opioid receptor antagonist cyprodime on PL017-produced analgesic effects in the mice writhing test

分組扭體次數(shù)P動物數(shù)/只生理鹽水50.38±2.26-8cyprodime48.29±2.440.54#7PL0179.71±1.441.82×10-9#7cyprodime+PL01751.5±1.994.08×10-10*7

注：#表示與生理鹽水組進行顯著性比較；*表示與PL017組進行顯著性比較；-表示與生理鹽水組不進行顯著性比較。

表3皮下注射PL017(50～100μg·kg-1)對結(jié)腸排珠的調(diào)節(jié)

Tab.3 The effects of subcutaneous PL017 (50-100 μg·kg-1) on bead expulsion latency

分組劑量/μg·kg-1排珠潛伏期/sP動物數(shù)/只生理鹽水0394±33.49-8PL01750437±51.980.4907PL017100559.75±67.98 0.0468

注：-表示與生理鹽水組不進行顯著性比較。

3.4PL017對排便的調(diào)節(jié) 考慮到阿片類藥物相關(guān)性便秘是藥物調(diào)節(jié)胃腸蠕動及消化液分泌等的綜合表征[18-19]，以糞便顆粒的數(shù)量和干質(zhì)量為指標(biāo)來評價皮下注射PL017對小鼠排便的調(diào)節(jié)。相較于生理鹽水組(6.33±0.49個，71.17±6.69 mg)，300 μg·kg-1PL017組小鼠的糞便顆粒數(shù)(4.17±0.6個，P=0.019)和糞便顆粒干質(zhì)量(43.67±5.28 mg，P=0.009)明顯減少。100 μg·kg-1PL017雖然能一定程度上抑制小鼠的排便數(shù)量(5.50±0.76個，P=0.380)和糞便干質(zhì)量(60.00±10.19 mg，P=0.210)，但差異不顯著。見表4。

表4皮下注射PL017(100～300μg·kg-1)對小鼠排便的調(diào)節(jié)

Tab.4 The effects of subcutaneous PL017 (100-300 μg·kg-1) on fecal pellet output in mice

分組劑量/μg·kg-1數(shù)量/個P干質(zhì)量/mgP動物數(shù)/只生理鹽水06.33±0.49-71.17±6.69-6PL0171005.50±0.76 0.380 60.00±10.19 0.2106PL0173004.17±0.60 0.01943.67±5.280.0096

注：-表示與生理鹽水組不進行顯著性比較。

4 討論

作為μ阿片受體激動劑阿片的類似物，PL017的穩(wěn)定性和生物活性都有了明顯的提升[6，9]。在中樞水平上，側(cè)腦室注射的PL017在熱板實驗中表現(xiàn)出強有力的鎮(zhèn)痛效果(ED50=0.012 μg·只-1)，對胃腸推進有顯著的抑制作用(ED50=0.038 μg·只-1)。PL017在鎮(zhèn)痛和胃腸調(diào)節(jié)中的ED50相差3.16倍，意味著側(cè)腦室注射PL017的鎮(zhèn)痛藥效與胃腸不良反應(yīng)在一定程度上是可以分開的[10]。鑒于熱板實驗的縮足行為有高位中樞的參與及PL017極其有限的血腦屏障通透性，因此比較PL017在外周皮下給藥時對熱板急性痛(ED50=30.2 mg·kg-1)與胃腸推進(ED50=0.37 mg·kg-1)的調(diào)節(jié)活性不合理[9]。因此，本實驗選擇經(jīng)典的外周痛模型(醋酸扭體模型)來評價PL017的外周鎮(zhèn)痛效力。此外，通過末端結(jié)腸排珠和排便實驗，進一步評價PL017在外周水平對胃腸的調(diào)節(jié)作用。

與相同給藥途徑的熱板鎮(zhèn)痛相比(ED50=30.2 mg·kg-1)[9]，皮下注射PL017在醋酸扭體模型中表現(xiàn)出更強效的鎮(zhèn)痛作用(ED50=9.76±1.36 μg·kg-1)，見表1。該鎮(zhèn)痛效果可被cyprodime完全阻斷，表明PL017可能是通過激活μ阿片受體發(fā)揮其外周鎮(zhèn)痛的，見表2。皮下注射50 μg·kg-1PL017不會延遲小鼠的排珠潛伏期，而30 μg·kg-1PL017卻能有效地抑制胃腸推進(ED50=0.37 mg·kg-1)[9]。也就是說，與上消化道相比，末端結(jié)腸對PL017表現(xiàn)出更高的敏感性，這或許是因為μ阿片受體在結(jié)腸和直腸比在上消化道有更廣泛的表達和分布[20]。在外周皮下給藥時，PL017調(diào)節(jié)胃腸推進、結(jié)腸排珠、排便的有效劑量遠高于其鎮(zhèn)痛劑量，意味著PL017在發(fā)揮其外周鎮(zhèn)痛效力時，不會造成胃腸功能紊亂等不良反應(yīng)。

綜上所述，本實驗探究了μ阿片受體激動劑PL017在經(jīng)典的外周炎性痛醋酸扭體模型中的鎮(zhèn)痛活性；相對較低的有效鎮(zhèn)痛劑量，表明PL017具有一定的治療外周內(nèi)臟痛的潛力。