陳瑤，王洪林，安莉君，曹慧玲，鄭國棟，郭遠(yuǎn)強(qiáng)

(1.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300350；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；3.北京修成藥業(yè)有限公司，北京 100085)

急性軟組織損傷是臨床骨科常見和多發(fā)疾病之一，一般是指由于外力間接或直接作用于人體，造成的局部組織腫脹或微小血管的壁破裂[1]。無菌性炎癥是急性軟組織損傷后發(fā)生的最重要的病理變化[2]，臨床上可以通過多種方式表現(xiàn)出損傷，包括局部腫脹、肌纖維斷裂、疼痛、皮膚青紫瘀斑和肢體功能障礙等。有研究表明，受損處出血會(huì)導(dǎo)致缺氧、缺血，引起組織細(xì)胞有氧呼吸破壞，影響細(xì)胞線粒體中氧化磷酸化過程，從而導(dǎo)致ATP生成減少或停止，引起軟組織損傷[3]。急性軟組織損傷嚴(yán)重影響人們的健康和工作能力，如不及時(shí)治療甚至可能導(dǎo)致患者自理能力受阻[4]，目前受到了越來越多研究者的重視。

中成藥千山活血膏(國藥準(zhǔn)字Z20025596)是采用現(xiàn)代提取技術(shù)制備而成的攤于布上黑膏劑，由土鱉蟲、大黃、三七、延胡索、血竭、續(xù)斷、黃柏、乳香、沒藥、兒茶、細(xì)辛、千年健、山慈菇、澤瀉、山羊角、木香、白及、白芷、桂枝、羌活、紅丹、芝麻油共22味中藥制備而成。土鱉蟲、大黃、三七、延胡索、乳香、沒藥具有活血化瘀、舒筋活絡(luò)、消腫止痛的功效，千年健可壯筋骨、止痛和消腫。千山活血膏可廣泛用于肌膚關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動(dòng)不利，以及跌打損傷，腰、膝部骨性關(guān)節(jié)炎等癥狀者[5-6]。然而，目前還沒有千山活血膏治療急性軟組織損傷的報(bào)道。

本研究通過構(gòu)建急性軟組織損傷大鼠模型，研究了千山活血膏用于治療急性軟組織損傷的療效及其作用機(jī)制，為千山活血膏廣泛推廣于臨床提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重(190 ± 10)g，均購于北京軍事科學(xué)院動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK(津)2019-0001。所有大鼠均飼養(yǎng)于天津南開大學(xué)動(dòng)物中心動(dòng)物房，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼養(yǎng)籠(6只/籠)。飼養(yǎng)條件：人工照明(12 h光照/12 h黑暗)，相對(duì)濕度60%±10%，溫度(25±2)℃。所有大鼠均自由飲食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 主要儀器 I2000型數(shù)字電子秤購于深圳市無限量衡器有限公司。JT-12S型自動(dòng)組織脫水機(jī)購于武漢俊杰電子有限公司。BMJ-A型包埋機(jī)購于常州市中威電子儀器有限公司。HM525NX型石蠟切片機(jī)及MX35型超優(yōu)刀片均購于賽默飛世爾科技公司。BX51型顯微鏡及DP70型照相系統(tǒng)均購于Olympus有限公司。LOGENE-I醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)軟件及Digital Imagine數(shù)字圖像采集軟件2.1版均購于無錫市朗珈生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

1.3 藥品與試劑 千山活血膏由北京修成藥業(yè)有限公司提供；雙氯芬酸二乙胺乳膠劑/扶他林(進(jìn)口H20160648)購于中美天津史克制藥有限公司；大鼠前列腺素E2(PGE2)酶聯(lián)免疫法試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫法試劑盒均購于武漢博士德生物科技有限公司；乙醇及二甲苯均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4%多聚甲醛、蘇木素及伊紅均購于湖北百奧斯生物有限公司。

1.4 急性軟組織損傷大鼠模型的建立 造模前1 d，用剃毛刀剃除所有大鼠左側(cè)臀部及大腿后側(cè)毛，而后使用8%的硫化鈉清除細(xì)小毛發(fā)，選擇大腿中部外側(cè)軟組織做好標(biāo)記。所有大鼠用10%的水合氯醛進(jìn)行全身麻醉，將大鼠左下肢平放，固定于急性軟組織損傷造模裝置操作平板上；然后使用50 g砝碼從100 cm高度空心管的頂部自由落體擊中大鼠左下肢軟組織，連續(xù)擊打3次，打擊部位出現(xiàn)面積約1 cm2的明顯皮下出血及腫脹。肉眼觀察，打擊后出現(xiàn)腫脹、青紫、瘀斑，但無皮膚破損；單側(cè)后肢跛行，但無骨折及脫位征，無其他異常情況發(fā)生，表明造模成功。

1.5 動(dòng)物分組及給藥 用自制軟組織打擊器建立急性軟組織損傷大鼠模型，90只雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組，扶他林(0.5 g /只/天)組和千山活血膏(0.5 g /只/天)組，每組30只大鼠，每天給藥1次，連續(xù)15 d。造模后第1、4、7、15天分別記錄各組大鼠的活動(dòng)狀態(tài)和體重。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 分別取造模后的第1、4、7、15天各組大鼠損傷組織，加入9倍體積的PBS進(jìn)行勻漿，離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGE2的含量變化，步驟嚴(yán)格參照酶聯(lián)免疫法試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 病理組織學(xué)檢查 分別取造模后第1、4、7、15天各組大鼠固定后的肌肉組織，常規(guī)石蠟包埋，切片厚 4～5 μm，進(jìn)行 HE染色，顯微鏡下觀察切片中組織出血情況、肌纖維以及炎性細(xì)胞浸潤。

采用盲評(píng)法[7-8]分別對(duì)造模后第1、4、7、15天各組大鼠軟組織損傷證候指數(shù)以及軟組織病理切片進(jìn)行評(píng)分(見表1)。

表1 軟組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

注：得分越高說明受損傷程度越嚴(yán)重

2 結(jié)果

2.1 千山活血膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠活動(dòng)及體重的影響 造模后第1天，3組大鼠均不活躍，跛足前行。造模后第4天，扶他林組與千山活血膏組大鼠腿部損傷有所好轉(zhuǎn)，活動(dòng)較第1天稍有活躍，模型組無變化。造模后第7天，3組大鼠活動(dòng)較為積極，模型組跛行明顯，扶他林組與千山活血膏組大鼠跛行不明顯。造模后第15天，模型組大鼠仍有部分跛行，扶他林組與千山活血膏組大鼠走動(dòng)正常、活躍。

分別在造模后第1、4、7、15天記錄各組大鼠體重變化，如圖1。由此圖可看出，各組大鼠體重增長趨勢(shì)一致，軟組織損傷并未對(duì)大鼠體重造成影響，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)3組大鼠體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 千山活血膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠肌肉組織炎癥因子的影響 如圖2，與模型組相比，給藥4 d后扶他林組和千山活血膏組均未對(duì)幾種炎癥因子的表達(dá)水平造成影響。而給藥7 d和15 d后，扶他林組和千山活血膏組顯著降低了TNF-α和IL-1β的水平。對(duì)于PGE2，扶他林與千山活血膏無論用藥4 d，還是7、15 d均不能顯著降低PGE2的含量，3組之間PGE2的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 千山活血膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠體重的影響

圖2 千山活血膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠炎癥因子的影響(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

2.3 軟組織損傷癥候指數(shù)評(píng)分結(jié)果 軟組織損傷癥候指數(shù)評(píng)分，如表2所示，結(jié)果表明，造模后1 d，3組大鼠軟組織損傷癥候指數(shù)評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用藥4 d后扶他林與千山活血膏均能顯著改善軟組織損傷，尤其是千山活血膏(P<0.01)。扶他林與千山活血膏差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 3組大鼠軟組織損傷癥候指數(shù)評(píng)分

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 3組大鼠損傷組織形態(tài)學(xué)觀察 分別取造模后第 1、4、7天損傷組織邊緣處新鮮肌肉組織，制備石蠟切片，HE染色后在顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化，如圖3。造模后1 d，3組大鼠肌肉組織切片均可見大量或灶性出血，炎性細(xì)胞擴(kuò)散、浸潤，肌纖維間隙腫脹變形，組織溶解，細(xì)胞界限不清，肌纖維斷裂變性壞死。造模后4 d，模型組仍有部分的炎性細(xì)胞浸潤，兩給藥組可見炎癥細(xì)胞少量散在分布，組織水腫及出血較之前減輕；肌纖維間隙雖腫脹，但出血肌肉纖維斷裂壞死有所改善，肌纖維排列稍恢復(fù)。造模后7 d，模型組肌纖維排列紊亂，肌纖維間隙稍腫脹，較多炎性細(xì)胞浸潤，散在灶性出血。扶他林組和千山活血膏組損傷肌纖維變性、壞死、肌纖維間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤的情況被顯著改善。造模后15 d，模型組仍見細(xì)胞間質(zhì)出血，少量炎性細(xì)胞浸潤；千山活血膏組和扶他林組肌纖維間隙組織間液中基本未見炎性細(xì)胞，無毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，無纖維斷裂情況，細(xì)胞間隙明顯，成纖維細(xì)胞增多。

圖3 千山活血膏治療急性軟組織損傷大鼠組織形態(tài)學(xué)變化(100×)

此外，我們對(duì)3組大鼠軟組織進(jìn)行病理評(píng)分，如表3。造模后7 d和15 d，與模型組相比，扶他林組和千山活血膏組病理評(píng)分均顯著降低，這進(jìn)一步表明了千山活血膏對(duì)損傷大鼠有良好的治療效果。

表3 3組大鼠軟組織切片病理評(píng)分

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

急性軟組織損傷作為一種常見的骨科疾病，以皮膚下組織，包括肌肉、韌帶、筋膜、肌腱、滑膜、脂肪、關(guān)節(jié)囊外周神經(jīng)和血管，但不包括骨骼中的一系列急性挫傷或撕裂，為特征[9]。急性軟組織損傷通常由外力引起局部腫脹、疼痛、功能障礙和瘀傷等癥狀，其主要病理變化參與外傷性無菌性炎癥反應(yīng)，以局部組織壞死、毛細(xì)血管擴(kuò)張、白細(xì)胞浸潤、水腫和出血為表現(xiàn)。軟組織損傷屬于中醫(yī)學(xué)“筋傷”范疇，“氣滯血瘀、血溢脈外、脈絡(luò)不通”是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)軟組織損傷的病機(jī)認(rèn)識(shí)。如《瘍醫(yī)大全》所描述，“有跌傷骨傷，治法宜活血祛瘀為先，血不活則瘀不去，瘀不去則骨不能接也”。中醫(yī)外用藥常用于治療軟組織損傷，在我國歷史悠久，一方面價(jià)格低廉、使用方便；另一方面局部用藥，療效確切、藥力可直達(dá)病所。研究表明，藥物透皮吸收給藥具有避免肝臟的首過效應(yīng)、避免對(duì)胃腸道刺激、延長有效作用時(shí)間、給藥方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[10]。因此，經(jīng)皮給藥逐漸受到越來越多研究者的重視和青睞。

最近研究表明，急性軟組織損傷模型被廣泛用于研究眾多藥物的抗炎作用[11-12]。盡管其病因與臨床急性軟組織損傷的病因會(huì)有所差別，但其病理和臨床病理表現(xiàn)相似[11]。本研究使用50 g砝碼從100 cm高度空心管的頂部自由落體擊中大鼠左下肢軟組織，模擬臨床急性軟組織損傷的發(fā)生，建立急性軟組織損傷的大鼠模型，探究千山活血膏對(duì)急性軟組織損傷的治療效果。分析大鼠活動(dòng)狀態(tài)及體重結(jié)果表明，軟組織損傷以及千山活血膏藥物的使用均并未對(duì)大鼠體重造成影響，千山活血膏卻能顯著改善急性軟組織損傷大鼠活動(dòng)狀態(tài)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，機(jī)體受到損傷會(huì)引起游離神經(jīng)末梢周圍組織產(chǎn)生充血水腫等炎癥反應(yīng)。軟組織損傷會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)，釋放一系列炎癥因子、致痛性炎癥介質(zhì)，可直接導(dǎo)致疼痛，炎癥局部的腫脹壓迫神經(jīng)末梢也可引起疼痛。PGE2是重要的炎癥介質(zhì)，能夠降低痛閾，在創(chuàng)傷中起重要作用[13]。TNF-α、IL-1β是兩個(gè)主要的促炎細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)早期[14-15]。TNF-α能夠促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6等的產(chǎn)生，進(jìn)而引起連鎖反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)。IL-1β是炎癥反應(yīng)中重要的促炎因子，未受到損傷時(shí)，IL-1β在體內(nèi)的含量較低，當(dāng)組織受到損傷時(shí)，IL-1β的含量急劇上升，因此血液及局部組織中的IL-1β含量可作為炎癥的嚴(yán)重程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，中成藥三七活血片能顯著降低急性軟組織損傷大鼠組織PGE2含量[1]。中成藥金黃凝膠也能顯著降低急性軟組織損傷大鼠血清PGE2含量[16]。與前人研究不同，本研究3組之間PGE2的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本結(jié)果提示千山活血膏沒有介導(dǎo)炎癥因子PGE2參與急性軟組織損傷。分析其原因主要是因?yàn)楦嗨庰ぴ诖笫笸壬希咳涨謇頃?huì)對(duì)其造成一定的疼痛，導(dǎo)致PGE2含量變化不明顯。對(duì)于炎癥因子TNF-α、IL-1β，千山活血膏表現(xiàn)出與扶他林相同的抗炎消腫效果，與前人研究結(jié)果相似[16-18]。紀(jì)春梅等[19]研究表明扶他林治療急性軟組織疼痛取得良好的效果。本結(jié)果提示千山活血膏可能是通過調(diào)控TNF-α、IL-1β炎癥因子發(fā)揮作用，從而改善急性軟組織損傷。

此外，軟組織損傷癥候指數(shù)評(píng)分、組織病理學(xué)分析結(jié)果與組間TNF-α、IL-1β含量變化一致，也與前人研究結(jié)論一致[16,20]，以上有力地支持了我們的結(jié)論。造模后用藥7 d及用藥15 d，千山活血膏表現(xiàn)出與扶他林治療急性軟組織損傷相似的療效，千山活血膏組大鼠軟組織損傷癥候指數(shù)評(píng)分、組織病理學(xué)評(píng)分均與傷扶他組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性，雖驗(yàn)證了千山活血膏對(duì)于大鼠的急性軟組織挫傷的治療機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)其炎癥因子，但并未確切的進(jìn)行調(diào)節(jié)通路以及其他可能調(diào)節(jié)蛋白的研究。進(jìn)一步檢測(cè)血液流變學(xué)等方面的指標(biāo)，仍具有重要意義。

總之，本研究闡明了千山活血膏治療急性軟組織挫傷的可能機(jī)制，同時(shí)為千山活血膏臨床治療的療效以及治療周期提供了科學(xué)的依據(jù)。本研究表明千山活血膏對(duì)治療急性軟組織損傷具有較好的療效，其可能是通過調(diào)控TNF-α、IL-1β炎癥因子發(fā)揮作用，從而改善急性軟組織損傷。千山活血膏具有與扶他林相似的抗炎消腫效果，值得在臨床上推廣。