聶文冰，尹鴻萍

(中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T,CAR-T)療法是一種在體外分離患者T細(xì)胞后，利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)座子技術(shù)等對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其攜帶CAR基因，在回輸入患者體內(nèi)后對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別并殺傷的技術(shù)。其發(fā)揮作用的關(guān)鍵在于CAR的設(shè)計(jì)。CAR主要包含3個(gè)部分：胞外抗原識(shí)別區(qū)ScFv，跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。根據(jù)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的不同，其又可分為4代[1-2]，一代CAR胞內(nèi)部分只含有CD3-zeta結(jié)構(gòu)域，修飾后T細(xì)胞擴(kuò)增困難，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示其在小鼠體內(nèi)的持久性較弱，因而療效不佳[3]；二代CAR中除了CD3-zeta結(jié)構(gòu)域，額外含有一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域如CD28、4-1BB等，可顯著促進(jìn)T細(xì)胞擴(kuò)增；三代CAR中包含兩個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，CD28、4-1BB、OX40等；四代CAR將額外的分子原件如自殺基因，白介素基因等插入到CAR中一方面提高CAR的安全性，另一方面表達(dá)功能蛋白，使其更好地發(fā)揮作用[4]。目前CAR-T療法在血液瘤中包括急性B淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤等的治療方面取得了顯著成效。然而其針對(duì)實(shí)體瘤的治療仍有待解決，主要是實(shí)體瘤中合適的靶點(diǎn)尋找受限、T細(xì)胞難以浸潤(rùn)腫瘤部位以及腫瘤微環(huán)境的免疫抑制等原因引起[5]。

為了確保CAR-T的療效需要T細(xì)胞在體外能夠快速增殖。目前IL-2已經(jīng)是公認(rèn)的可促進(jìn)T細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子。在naive T細(xì)胞被激活后，效應(yīng)T細(xì)胞可分泌IL-2并且增加IL-2受體的表達(dá)，從而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。但是其本身對(duì)體內(nèi)存在的naive T細(xì)胞以及memory T細(xì)胞的促增殖作用有限。在研究中，實(shí)驗(yàn)者常常額外加入IL-7/IL-15來(lái)確保T細(xì)胞的增殖能力，本文主要就IL-7、IL-15促增殖作用的機(jī)制以及其在CAR-T免疫療法中的臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 IL-7及IL-15的作用原理

1.1 IL-7的作用原理 人IL-7是一種由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的，分子量為25 kDa左右的糖蛋白[6]。其基因長(zhǎng)度為72 kb，位于染色體8q12～13上，由177個(gè)氨基酸構(gòu)成。分子上含有3個(gè)糖基化位點(diǎn)，根據(jù)糖基化程度的不同，體外蛋白水平檢測(cè)時(shí)可于20、25、28 kDa左右出現(xiàn)3條蛋白條帶。IL-7的受體由高親和力受體α鏈(CD127)以及γc鏈(CD132)組成異二聚體[7-8]。

如圖1所示，當(dāng)IL-7與其受體結(jié)合后，主要依賴(lài)兩條信號(hào)通路發(fā)揮作用：JAK-STAT通路以及pI3K-AKt通路[9-10]。經(jīng)pI3K-AKt通路，IL-7一方面下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)抑制蛋白p27kipl的表達(dá)，另一方面促進(jìn)周期蛋白cyclinD1的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。另一方面，當(dāng)IL-7與其受體結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)JAK1及JAK3的激活，磷酸化STAT蛋白。磷酸化的STAT蛋白會(huì)形成異二聚體然后進(jìn)入細(xì)胞核激活抗凋亡基因如Bcl-2和Mcl-1表達(dá)，抑制促凋亡蛋白如Bax和Bak等的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。通過(guò)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，IL-7可促進(jìn)自身Naive T細(xì)胞以及記憶T細(xì)胞的增殖，對(duì)CAR-T療法具有重要意義。

圖1 IL-7的信號(hào)通路圖

1.2 IL-15的作用原理 IL-15因子于1994年被Giri等[11]發(fā)現(xiàn)并命名，其編碼基因位于染色體4q31上，由162個(gè)氨基酸構(gòu)成分子量為14～15 kDa的糖蛋白。其中48個(gè)氨基酸構(gòu)成前導(dǎo)序列，114個(gè)氨基酸形成成熟的IL-15亞基。IL-15分子中含有2個(gè)二硫鍵以及2個(gè)糖基化位點(diǎn)使其構(gòu)成4個(gè)α-螺旋束結(jié)構(gòu)。IL-15的受體同IL-2一樣為異源三聚體，由IL-15Rα、IL-2/15Rβ及γc鏈組成。其是除IL-2外，唯一與IL-2共享受體β鏈的因子[12]。

如圖2所示，多數(shù)情況下IL-15與高親和力配體IL-15Rα結(jié)合形成復(fù)合物表達(dá)于多種細(xì)胞表面。當(dāng)細(xì)胞被激活后，信號(hào)經(jīng)IL-15/IL-15Rα反式遞呈到表達(dá)β/γc受體的效應(yīng)細(xì)胞中，主要經(jīng)JAK/STAT、pI3K-AKt以及MAPK 3條信號(hào)通路調(diào)節(jié)下游效應(yīng)分子如Bcl-2、Bim、NF-κB、IFN-γ等發(fā)揮作用[13-15]。當(dāng)JAKs被激活后，一方面促使STAT磷酸化入核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)；另一方面，通過(guò)接頭蛋白Shc激活Grb2，Grb2既可作用于GAB2蛋白經(jīng)pI3K-AKt通路促進(jìn)細(xì)胞增殖及存活，又可與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子SOS結(jié)合形成Grb2-SOS復(fù)合物經(jīng)Ras-Raf途徑進(jìn)一步激活MAPK來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。與IL-7作用區(qū)別在于其主要經(jīng)反式信號(hào)傳遞來(lái)發(fā)揮作用，從而促進(jìn)記憶T細(xì)胞，特別是CD8+記憶T細(xì)胞的增殖。

圖2 IL-15的信號(hào)通路圖

2 IL-7及IL-15的體內(nèi)外作用

2.1 促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)外增殖 Zhou等[16]利用一個(gè)攜帶eGFP標(biāo)簽的anti-CD19 (4-1BB) CAR，轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細(xì)胞后，比較其在不同因子IL-2或IL-7/IL-15共刺激條件下，細(xì)胞的增殖、凋亡以及抗腫瘤作用的差異。盡管IL-2組細(xì)胞在2周內(nèi)可擴(kuò)增100倍左右，但是經(jīng)IL-7/IL-15共培養(yǎng)，細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)約為IL-2組的2倍多。并且抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，細(xì)胞具有低凋亡率。此外有研究顯示在IL-2 (50 U·mL-1)中培養(yǎng)的T細(xì)胞從第20天開(kāi)始細(xì)胞即有數(shù)量減少的趨勢(shì)，而在IL-7 (10 ng·mL-1)和IL-15 (10 ng·mL-1)中培養(yǎng)的T細(xì)胞在培養(yǎng)至35 d時(shí)仍有較好的擴(kuò)增趨勢(shì)[17]。Hoyos等[18]將CAR-19+與自殺基因iC9、細(xì)胞因子IL-15共表達(dá)，構(gòu)成一個(gè)新型的CAR載體，將其與常規(guī)的CAR19+相比較，每周以效靶比1∶2的比例用B細(xì)胞慢性淋巴性白血病CD19+刺激，共培養(yǎng)5周，作者發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的新型CAR體外擴(kuò)增相較于CAR-19+增加10倍。此外，將CAR-T細(xì)胞經(jīng)eGFP-FFLuc基因編輯后，經(jīng)小鼠體內(nèi)研究顯示攜帶IL-15的新型CAR-19+的擴(kuò)增速度要優(yōu)于CAR-19+3～15倍。

盡管在CAR-T研究中IL-2已有顯著的促增殖作用，但是其本身對(duì)部分T細(xì)胞的促增殖作用有限，通過(guò)與IL-7、IL-15聯(lián)合作用，可顯著提高整體CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增速率，從而在確?；剌攧┝康臈l件下可縮短培養(yǎng)時(shí)間，一方面減少操作時(shí)間，更易確保產(chǎn)品的質(zhì)量；另一方面保持CAR-T細(xì)胞的活性以達(dá)到最佳療效。

2.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞表型，減弱細(xì)胞分化，促進(jìn)存活 Xu等[19]比較了100 U·mL-1的IL-2與10 ng·mL-1的IL-7及5 ng·mL-1的IL-15培養(yǎng)條件下，CAR-T擴(kuò)增后表型變化以及體內(nèi)外抗B細(xì)胞惡性腫瘤的差異。研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-7/IL-15培養(yǎng)后，CAR-T終產(chǎn)品中CD8+CD45RA+CCR7+占比要明顯優(yōu)于IL-2培養(yǎng)組(31%±4% vs 14%±5%)。Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)攜帶IL-15的GD2.CAR-T細(xì)胞與神經(jīng)母細(xì)胞瘤CHLA255共孵育后與單純的GD2.CAR相比，可明顯增加IL-15的表達(dá)，并降低細(xì)胞分化水平，使TSCM/TCM細(xì)胞亞群占比較高(25%±11% vs 6%±2%,P<0.001)。并從轉(zhuǎn)錄水平上降低耗竭標(biāo)記PD-1以及LAG-3的表達(dá)。因此可從體內(nèi)外在無(wú)外源因子以及抗原刺激的條件下促進(jìn)CAR-T增殖并延長(zhǎng)其存活。Alizadeh的研究顯示，IL-15可通過(guò)降低mTORC1的活性使T細(xì)胞維持TSCM表型，促進(jìn)細(xì)胞存活[21]。

在T細(xì)胞亞群中，盡管效應(yīng)T細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，而低分化的TN、TSCM、TCM細(xì)胞亞群在體內(nèi)的存活時(shí)間更長(zhǎng)，具有更佳的增殖潛力，對(duì)于CAR-T療效的持久性具有重要作用。在IL-2培養(yǎng)的條件下，T細(xì)胞的分化程度較高，盡管短時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用優(yōu)于IL-7/IL-15共培養(yǎng)組，但是其作用持久性較弱。IL-7、IL-15共培養(yǎng)條件下，可減弱細(xì)胞分化，增加TSCM以及TCM細(xì)胞的比例，從而延長(zhǎng)CAR-T在體內(nèi)生存期，對(duì)增加體內(nèi)外抗腫瘤療效具有重要意義。

2.3 提高細(xì)胞毒作用 除了促進(jìn)細(xì)胞增殖及存活外，IL-15還可通過(guò)增加穿孔素及顆粒酶的產(chǎn)生、促進(jìn)產(chǎn)生IFN-γ及TNF-α等因子來(lái)增加淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。Yao等[22]從健康招募者外周血內(nèi)獲得雙陰性T細(xì)胞(DNTs)后在體外經(jīng)5 μg·mL-1anti-CD3抗體激活后培養(yǎng)15～20 d。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNTs額外用IL-15培養(yǎng)后，其可增加DNTs表面NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp44、顆粒酶B、穿孔素等表達(dá)，并促進(jìn)IFN-γ及sTRAIL的分泌，從而增加體內(nèi)外DNTs對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。此外，有研究顯示盡管IL-7/IL-15培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞共孵育后對(duì)體外因子釋放以及細(xì)胞毒作用與IL-2組無(wú)顯著差異，但是小鼠模型顯示，輸注IL-7/IL-15 CAR-T細(xì)胞的小鼠抗腫瘤作用更強(qiáng)，并且小鼠的存活期更久[16]。因此相較于IL-2組，聯(lián)合IL-7、IL-15共培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞作用效果更佳。

3 IL-7及IL-15的臨床應(yīng)用

關(guān)于IL-7/IL-15的臨床應(yīng)用主要涉及兩個(gè)方面，一方面是在體外培養(yǎng)CAR-T的過(guò)程中外加IL-7及IL-15來(lái)考察CAR-T的療效；另一方面即在CAR設(shè)計(jì)過(guò)程中，直接將IL-7或IL-15與CAR的基因連接，形成一個(gè)嵌合抗原受體后來(lái)評(píng)估其療效。在重慶新橋醫(yī)院開(kāi)展的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)通過(guò)IL-7/IL-15體外培養(yǎng)來(lái)替換原來(lái)的IL-2培養(yǎng)，旨在判斷輸注淋巴瘤患者后，IL-7/IL-15培養(yǎng)的抗CD19 CAR-T細(xì)胞是否能在體內(nèi)持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間，以及CAR-T細(xì)胞的持久性是否可以提高抗淋巴瘤的療效。錢(qián)文斌等通過(guò)2A肽段將IL-7以及趨化因子CCL19與CD19.CAR構(gòu)建成新的嵌合抗原受體，用于治療B細(xì)胞淋巴瘤。同樣的，在溫州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院開(kāi)展的一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)也利用四代CAR (含IL-7/CCL19/IL-21)用于治療Nectin-4/FAP高表達(dá)的實(shí)體瘤。一項(xiàng)關(guān)于 iC9.GD2.CAR.IL-15 T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)/難治性神經(jīng)母細(xì)胞瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)也正在北卡萊茵伯格綜合癌癥中心展開(kāi)。

通過(guò)表1所示這些臨床試驗(yàn)，根據(jù)患者輸注后的應(yīng)答情況可以直觀的考察IL-7/IL-15與CAR-T聯(lián)用后，CAR-T免疫療法的療效是否得到顯著提升，從而更好地為患者帶來(lái)福音。

表1 IL-7/IL-15在CAR-T免疫療法中的臨床應(yīng)用

4 結(jié)語(yǔ)

迄今為止，CAR-T療法在腫瘤治療領(lǐng)域方興未艾，截至目前共有429項(xiàng)涉及不同種類(lèi)腫瘤、不同靶點(diǎn)的CAR-T臨床項(xiàng)目在全球展開(kāi)，我國(guó)多家醫(yī)療企業(yè)、機(jī)構(gòu)也在開(kāi)展多項(xiàng)針對(duì)不同腫瘤的CAR-T臨床試驗(yàn)，而IL-7及IL-15因子已顯示出對(duì)CAR-T優(yōu)異的促增殖作用，可使CAR-T減弱分化表型，延長(zhǎng)體內(nèi)存活，增加其療效。在體外培養(yǎng)過(guò)程中將IL-7/IL-15替代IL-2；或與IL-2連用；或者在CAR的設(shè)計(jì)過(guò)程中加入IL-7/IL-15基因均有利于CAR-T療效。然而IL-7及IL-15因子對(duì)CAR-T療法的療效針對(duì)患者而言具體有多大的提升作用還需要臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步支撐。