李貴節(jié)，程玉嬌，張群琳，周琦，談安群，張騰輝，吳厚玖，趙曉春，RUSSELL L ROUSEFF *，梁國魯

1(西南大學 柑桔研究所 國家柑桔工程技術研究中心，重慶，400712) 2(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，400067)3(成都市華測檢測技術有限公司，四川 成都，610041) 4(西南大學 園藝園林學院，重慶，400715)

6′,7′-環(huán)氧佛手柑素(6′,7′-epoxybergamottin, 6′,7′-EB)是補骨脂素的5-O-取代衍生物，屬于呋喃香豆素(furanoucoumarins, FCs)類物質。與之結構相似的物質還包括：佛手柑素、6′,7′-二羥佛手柑素(6′,7′-dihydroxybergamottin, 6′,7′-DHB)、異歐前胡素(isoimperatorin, IIR)、氧化前胡素、水合氧化前胡素、佛手柑內酯及佛手酚等(見圖1)。FCs廣泛分布于以蕓香科和傘形科為代表的高等植物中[1-2]，具有抗艾滋病、抗菌、抗血小板凝集、抗癌、抗結核、抗驚厥以及護肝等生理活性[3-9]。

R=a-佛手柑素;b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素;c-6′,7′-二羥佛手柑素;d-異歐前胡素;e-氧化前胡素;f-水合氧化前胡素;g-佛手柑內酯；h-佛手酚圖1 柑橘中常見5-O-取代呋喃香豆素的結構Fig.1 Structures of common 5-O-substituted furanocoumarins in citrus species

以葡萄柚為代表的某些柑橘中含有6′,7′-EB及其衍生物，它們還具有抑制哺乳動物細胞色素P450(cytochrome P450, CYP)的作用[10]，使CYP依賴的藥物代謝減緩，對于正在服藥的患者具有一定的風險[11-13]。該抑制作用的強弱與側鏈取代基的結構有關[14]。ROW等[15]認為5-O-側鏈烴基長度與FCs的抑制效果呈正相關，取代基上存在烯鍵和6′,7′-親水基團也會增強抑制作用，并研究得到上述FCs對小腸S9組分CYP3A4的半抑制濃度為6′,7′-EB

柑橘汁是柑果的主要加工產品，不同品種的柑橘汁中FCs的組成和含量各不相同，如甜橙和寬皮桔汁幾乎不含FCs，葡萄柚汁含6′,7′-DHB和佛手柑素等[3]，而柚子汁含有氧化前胡素和6′,7′-EB等[16]；不同成熟期、灌裝方法和貯藏條件對同一品種柑橘汁所含FCs也有影響[17]；果肉的不同組分如汁胞液、汁胞壁、囊瓣壁等在加工破碎過程中對果汁FCs的貢獻比例也有顯著差異[18]。因此，要深入研究柑橘汁產品對人體CYP的作用，需能準確地定性、定量分析其中的FCs并進一步了解其變化情況。前期研究[19]發(fā)現，對pH 3.5的葡萄柚汁做6′,7′-EB和6′,7′-DHB的加標回收實驗，前者回收率低于75%，而后者回收率高達120%以上。由此推測在該酸性條件下部分6′,7′-EB轉化為6′,7′-DHB，即5-O-取代側鏈上的環(huán)氧基開環(huán)并與水分子結合生成對應的鄰二醇。此類反應的開環(huán)速率與質子酸催化劑的強度密切相關[20]，因而柑橘汁酸度將對反應速率和進程產生重要的影響。

迄今尚未有果汁中6′,7′-EB等FCs的變化及反應產物和速率的報道。過往對食品成分化學反應的動力學研究大多關注單一反應物的簡單反應速率[21-22]，所用檢測方法常為滴定、比色等傳統(tǒng)方法[22-23]，近年來才逐步采用色譜法及其聯(lián)用技術，并同時對反應產物進行定性和定量分析[24-27]。然而，它們都采用人工定時取樣的方式，且部分研究取樣后并未立即終止反應，難以避免誤差。本研究開發(fā)了一套柱前在線反應-高效液相色譜-二極管陣列檢測聯(lián)用的方法，通過全程自動控制，精確分析25 ℃常溫下不同酸度的模擬柑橘汁中6′,7′-EB的反應產物和反應速率，并通過實際果汁樣品予以驗證，從而探究柑橘汁加工過程中FCs的變化情況，為評價柑橘汁對CYP的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅葡萄柚(星路比)成熟果實，國家果樹種質資源柑橘圃(重慶)。

蔗糖、果糖、葡萄糖、維生素C和檸檬酸(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；NaOH(分析純)，天津市風船化學試劑科技有限公司。

標準對照品(HPLC級)：6′,7′-環(huán)氧佛手柑素、佛手酚、佛手柑素，美國ChromaDex公司；佛手柑內酯，加拿大TRC公司；6′,7′-二羥佛手柑素、異歐前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素，上海源葉生物有限公司。乙腈、甲醇、四氫呋喃、H3PO4(色譜純)，美國Honeywell公司；乙酸乙酯(分析純)，成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

裝配恒溫自動進樣器的HPLC-DAD系統(tǒng)(Infinity 1260)，安捷倫科技有限公司；阿貝折射儀(CAR-02)，Contech Instruments Ltd.；全自動數字pH計(FE28)，梅特勒-托利多(上海)有限公司；超純水系統(tǒng)(Milli-Q Reference)，德國Merck-Millpore公司；十萬分之一天平(SQP)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；高速冷凍離心機(Sorvall ST 16R)，賽默飛世爾科技有限公司；超聲波清洗器(SB-5200 DTN)、真空冷凍干燥機(Scientz-10ND)、組織研磨器(Scientz-192)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DouR@SPT-H型氮空吹掃濃縮儀，北京斯珀特科技有限公司；攪拌器(MultiQuick)，德國博朗電器。

1.3 實驗方法

1.3.1 模擬柑橘汁的配制

按PELEG等[28]方法并作修改：配制100.0 g糖溶液，含6.0 g蔗糖、3.0 g果糖和3.0 g葡萄糖，其余用水補足。配制1.0 mol/L檸檬酸溶液100 mL。分別取適量糖、酸溶液均勻混合，加入維生素C使其質量濃度為500.0 mg/L，得到模擬青檸汁(pH 2.0、7.8°Brix)、模擬葡萄柚汁(pH 3.5、9.2°Brix)和模擬沙田柚汁(pH 5.0、12.0°Brix)。準確吸取各模擬果汁950 μL于2.0 mL棕色樣品瓶中。

1.3.2 模擬柑橘汁在線反應控制

進樣器樣品盤控溫25 ℃，樣品準備和反應于樣品瓶中在線進行，設置并優(yōu)化自動化程序如下：

進樣針提針→甲醇潤洗進樣針外壁→吸取6′,7′-EB甲醇溶液50 μL→移入模擬柑橘汁樣品瓶→瓶內吹打(100 μL×3次)混勻→[甲醇清洗進樣針內外壁2次→吸取模擬柑橘汁反應液5 μL→吸取反應終止液5 μL→進樣，六通閥切換至旁路→進樣針提針→持續(xù)吹打(100 μL/min)混勻模擬柑橘汁反應液→單次HPLC分析結束前2 min提針]×N次→分析結束，徹底清洗進樣系統(tǒng)和全流路

其中反應終止液為NaOH溶液，pH 2.0反應體系對應濃度為10.0 mmol/L，pH 3.5/5.0反應體系對應濃度為0.3 mmol/L。

1.3.3 模擬反應體系的樣品分析條件

色譜柱：Thermo Scientific Accucore PFP(2.6 μm, 150 mm×4.6 mm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。流動相條件根據不同酸度下反應速率的快慢進行優(yōu)化。對pH 2.0體系采用等度洗脫，0～7 min保持V(水)∶V(乙腈)=35∶65。對pH 3.5和5.0體系采用梯度洗脫，流動相組成為：A水、B乙腈、CV(水)∶V(四氫呋喃)=50∶50；梯度程序為：0～4 min，57%A、15%B、28%C；6～10.5 min，35%A、35%B、30%C；10.51～20 min，后運行。檢測器設置：DAD掃描波長為 210～400 nm，定量檢測波長設為250 nm。

1.3.4 果肉和果汁樣品的前處理和色譜條件

成熟葡萄柚果實去外果皮后，小心清理囊衣上附著的白皮層和殘留筋絡，將裸露果球稱重。

果肉FCs提?。簩⒁阎|量的鮮果球粗分為4～6瓣，置于-45 ℃真空冷凍干燥機中脫水至恒重，經組織研磨器粉碎，加入適量乙酸乙酯進行超聲輔助提取(25 ℃, 300 W, 10 min)，重復3次，合并提取液并在40 ℃氮氣流下吹干，用甲醇重溶解并過0.22 μm濾膜后，得到葡萄柚果肉原始FCs粗提物。

果汁FCs提?。簩?批已知質量的鮮果球快速打碎成果漿，再分別進行超聲處理(25 ℃, 300 W)30和60 min，迅速加入適量0.1 mol/L NaOH溶液，將果漿pH調至5.0～7.0之間，終止酸誘導反應。果漿過單層紗布濾出果汁，果渣用少量清水洗滌3次，合并果汁和洗滌液，加入適量乙酸乙酯萃取，重復3次后合并有機相，后續(xù)步驟同果肉萃取。

色譜條件：采用安捷倫Poroshell 120 EC-C8色譜柱(2.7 μm，4.6 mm×150 mm)，流動相流速為1 mL/min，四元流動相組成：0.025%磷酸水溶液(A)、甲醇(B)、乙腈(C)和體積分數20%四氫呋喃水溶液(D)，采用周琦等[29]的HPLC梯度洗脫方法；DAD設置同模擬果汁檢測條件。

1.3.5 FCs成分的定性和定量分析

以紫外吸收光譜和色譜峰保留時間相結合的方法對模擬柑橘汁反應體系樣品以及葡萄柚樣品的FCs成分做定性分析。準確稱取各FCs標準物質溶于甲醇中，配制成濃度為40.0 mmol/L儲備液，逐級稀釋得到摩爾濃度為2.0、1.5、1.0、0.5、0.25、0.10和0.01 mmol/L的系列稀釋液，經HPLC測定后求出各物質的峰面積-濃度線性關系，采用外標法對樣品中的目標成分做定量分析。

1.3.6 數據統(tǒng)計與分析

所有數據均平行測定3次，結果表示為平均值±標準偏差。數據分析及圖表繪制由Excel 2016和Origin 8.5軟件完成。

2 結果與討論

2.1 環(huán)氧佛手柑素在線反應與自動化控制

傳統(tǒng)上，化學反應過程的在線分析一般依賴于專用或自研設備。隨著商品化液相色譜功能的日益增強，利用其恒溫、可編程的自動進樣系統(tǒng)作為原位在線反應控制單元，結合HPLC的分離和分析能力，使得對反應體系的定時取樣、反應生成物的定性鑒定以及反應速率的分析確定得以實現。進樣器六通閥可使流路在主路(main-pass)和旁路(by-pass)間切換：主路模式下，流動相經定量器、進樣環(huán)、進樣針和針座，推動樣品進入色譜柱；旁路模式下，上述進樣部件被短接，流動相直接泵送至色譜柱以維持流路?；趯αㄩy的充分利用，通過程序設置在分析樣品的同時維持反應液的吹打、混勻操作，保證了反應平穩(wěn)、充分。

為進一步消除從吸取反應液到反應終止前一小段時間對反應速率精確計算的影響，設計了進樣針連續(xù)吸取反應液和終止液而后迅速進樣的程序。由于進樣針內徑狹窄，兩段液柱接觸面極小，反應并不會立即終止；進樣后，針內液柱被流動相迅速帶到色譜柱前端，遇填料顆粒產生湍流而充分混合，此時反應終止。故每次進樣的時間點即為反應過程中的數據采集點，時間精度達0.01 min。由于從反應到分析的全過程操作均由機器完成，最大限度地排除了包括人工在內的各種偶然因素，因而分析誤差僅取決于儀器的系統(tǒng)誤差，具有很高的精度優(yōu)勢。

2.2 5-O-取代FCs的紫外光譜和定量方程

利用DAD對8個5-O-取代呋喃香豆素(a～h)標準品溶液進行掃描，得到各物質的紫外吸收光譜,如圖2所示。

a-佛手柑素;b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素;c-6′,7′-二羥佛手柑素;d-異歐前胡素;e-氧化前胡素;f-水合氧化前胡素;g-佛手柑內酯;h-佛手酚圖2 常見5-O-取代呋喃香豆素的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorbance spectra of common 5-O-substituted furanocoumarins

母環(huán)上相同位置取代的FCs紫外光譜具有相似性，但精確對比發(fā)現各物質的主峰(310 nm附近)和肩峰(250 nm附近)仍有2～5 nm的區(qū)別，其中佛手酚(5-羥補骨脂素)差異最明顯，羥基的存在減弱了母環(huán)的共軛效應，從而使主峰和肩峰都產生了約5 nm的藍移。通過與標準物質比對光譜和保留時間，能夠對模擬反應體系和真實樣品中的目標FCs準確定性。為避免溶劑在低波長端的干擾，選擇相對響應值較高的250 nm作為定量檢測波長。各物質的回歸方程如表1所示，相關系數R2在0.999 4～1.000 0之間。

表1 各呋喃香豆素的定量線性關系Table 1 Linearity of each furanocoumarins for quantitative analysis

注：A為色譜峰面積，c為濃度(μmol/L)

2.3 模擬果汁中6′,7′-EB的反應產物和速率分析

在25 ℃、pH 5.0的相對低酸性模擬果汁中6′,7′-EB基本穩(wěn)定，經過48 h反應僅有約0.3%損失，生成微量水合產物6′,7′-DHB，未檢出其他FCs(色譜圖略)。對常見酸果類柑橘(pH≈2.0)和汁用柑橘(pH≈3.5)模擬體系中6′,7′-EB反應進行分析，發(fā)現酸度是影響反應產物和速率的關鍵因素，酸性越強反應速率越快。

2.3.1 pH 2.0模擬體系

6′,7′-EB酸誘導反應過程中連續(xù)自動取樣分析的色譜圖如圖3-A所示。追蹤反應物和準確定性的2個產物的濃度變化情況，結果顯示，6′,7′-EB首先發(fā)生了平行反應(parallel reaction)，6′,7′-DHB為主反應產物，IIR為副反應產物；兩者的摩爾濃度都呈現先升高、后降低的趨勢，且極大值于約28 min同時出現(見圖3-B)，由此判斷6′,7′-DHB和IIR還發(fā)生了后續(xù)反應(consecutive reaction)，生成了其他未知物質。圖3-C顯示6′,7′-EB的ln(C0/Ct)值與反應時間的線性關系優(yōu)良(R2=0.998 1)，表明其濃度降低的過程符合一級反應規(guī)律。根據擬合方程得出6′,7′-EB在25 ℃ pH 2.0的模擬柑橘汁中表觀反應速率常數k’=0.071 4 min-1，其半壽期為9.71 min。

A-各取樣點反應樣品色譜圖;B-6′,7′-EB及其主要反應產物的濃度-時間曲線;C-6′,7′-EB按一級反應規(guī)律擬合的線性曲線b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素；c-6′,7′-二羥佛手柑素；d-異歐前胡素；由于系統(tǒng)誤差低，圖中未顯示誤差線圖3 25 ℃, pH 2.0模擬柑橘汁中6′,7′-EB酸誘導反應主要產物和動力學分析Fig.3 Major products and kinetic analysis of 6′,7′-EB acid induced reaction in pH 2.0 imitated citrus juice at 25 ℃

進一步分析反應過程，設6′,7′-DHB和IIR的后續(xù)反應表觀級數也是一級，將模擬柑橘汁中的復雜反應簡化如下(k1～k4為各簡化反應的表觀速率常數)：

考察6′,7′-EB、6′,7′-DHB和IIR的實時濃度：

得到各反應速率方程為：

(1)

(2)

(3)

6′,7′-DHB和IIR的濃度y1、y2積分通式為：

(4)

(5)

當[B]、[C]出現極大值時，公式(4)、(5)的一階導數為零，此時有：

(6)

(7)

(8)

(9)

如圖3-B所示，t1max=t2 max=28.0 min，y1max=1 206.2 μmol/L，y2max=168.4 μmol/L，C0=1 900 μmol/L，解出k1=0.066 7 min-1、k2=0.010 2 min-1、k3=0.016 2 min-1、k4=0.086 5 min-1。其中k1+k2與6′,7′-EB降低的速率常數k’接近(相對誤差約7.7%)，進一步驗證了6′,7′-EB發(fā)生2個平行反應的模型與實際情況相符。對于酸度接近pH 2.0的酸果類柑橘，在測得果肉中6′,7′-EB初始含量C0的基礎上，利用各速率常數通過公式(4)和(5)即可計算果實榨汁后任一時刻果汁中6′,7′-DHB和IIR的含量。

2.3.2 pH 3.5模擬體系

反應體系色譜圖及各物質濃度變化情況如圖4所示。由于酸度降低導致反應速率減緩，取樣間隔適當放寬，色譜分析時間也隨之延長。pH 3.5條件下，

A-各取樣點反應樣品色譜圖;B-6′,7′-EB及其主要反應產物的濃度-時間曲線;C-6′,7′-EB按一級反應規(guī)律擬合的線性曲線b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素;c-6′,7′-二羥佛手柑素;d-異歐前胡素圖4 25 ℃, pH 3.5模擬柑橘汁中6′,7′-EB酸誘導反應主要產物和動力學分析Fig.4 Major products and kinetic analysis of 6′,7′-EB acid induced reaction in pH 3.5 imitated citrus juice at 25 ℃注：由于系統(tǒng)誤差低，圖中未顯示誤差線

6′,7′-EB的降解仍服從一級反應規(guī)律，表觀速率常數k’=0.005 79 min-1，半壽期增至119.7 min，約是pH 2時的12倍。主副反應產物仍是6′,7′-DHB和IIR，但其濃度-時間曲線單調遞增并逐步趨緩，反應物和產物的物質總量也基本保持穩(wěn)定(圖4-B)，因此可以判斷模擬體系中只發(fā)生了平行反應的第一步，pH 3.5酸度不足以催化后續(xù)反應的進行。

此時2.3.1中公式(2)、(3)簡化為：

兩式相除有：

在6′,7′-DHB和IIR初始濃度均為0的條件下，上式進一步簡化為：

(10)

由圖4-B中6′,7′-DHB和IIR兩條曲線在各時間點對應的高度求得，k1/k2=12.22±0.57，代入公式(1)中得到：k1=0.005 35 min-1，k2=0.000 438 min-1。

2.4 葡萄柚汁中FCs組成和含量變化的計算預測和實驗驗證

葡萄柚是柚類的一種，在我國又稱西柚，是全球僅次于甜橙的第二大汁用柑橘類別，其中的紅肉品系在西方也用于鮮食。由于紅葡萄柚果汁色澤粉紅誘人，具有獨特的香氣和風味，近年來已逐漸被國人接受和喜愛。葡萄柚汁加工從榨汁、精濾、均質到脫氣等程序均在常溫中進行，耗時約半小時到數小時不等；非濃縮還原(not from concentrate, NFC)汁和濃縮汁還要經過短時高溫滅菌和蒸發(fā)等熱處理，而當前最高檔的超高壓處理(high pressure processing, HPP)果汁則全程都處于常溫狀態(tài)。可利用已獲得的6′,7′-EB反應機理和動力學參數，對常溫處理過程中葡萄柚汁FCs的組成和含量變化進行預測。

6′,7′-環(huán)氧佛手柑素與酸接觸反應從果實破碎即已開始，而果汁粗提物的前處理時間長達30 min以上，難以通過對果汁的檢測獲取FCs的準確初始含量，故采用冷凍干燥使紅葡萄柚果肉脫水再進行有機溶劑萃取。干燥果肉提取物及榨汁破碎30、60 min后的粗濾汁提取物的色譜圖如圖5所示，果肉和果汁中均未檢出氧化前胡素(e)和水合氧化前胡素(f)，而干燥原始果肉中未檢出異歐前胡素。

按果肉初始FCs含量計算果汁在2個時間點取樣的FCs含量，比較計算預測值與實測值之間的差異，結果如表2所示。由表2可見，6′,7′-EB(b)、6′,7′-DHB(c)和IIR(d)的預測值與實測值的相對偏差在10.1%～14.9%之間；同時發(fā)現佛手柑素(a)在果肉和果汁中的實測含量也呈現較大的偏差(9.9%和11.0%)。由于常溫下佛手柑素結構穩(wěn)定，不發(fā)生酸誘導反應，其濃度應基本不隨時間推移而變化，因而果肉與果汁間的測定差異應主要來源于前處理，即干燥果肉中的佛手柑素提取效率比果汁中更高；以干燥果肉提取效率為100%，30、60 min時果汁的相對提取效率為89.0%和90.1%，又由于b、c、d三物質的保留時間與a接近，可粗略認為它們的提取效率基本相同。據此，分別對2個時間點果汁中各FCs實測濃度進行修正，則果汁的實測修正值與預測值之間的相對偏差僅為：6′,7′-EB 0.8%和1.6%，6′,7′-DHB 2.2%和2.3%，IIR 3.4%和5.6%。該結果說明25 ℃模擬果汁動力學方程與實際反應基本相符，利用本方法能夠較準確地預測pH約為3.5的柑橘汁加工過程中，6′,7′-EB及其相關FCs產物的組成和含量變化。

a-佛手柑素;b-6′,7′-環(huán)氧佛手柑素;c-6′,7′-二羥佛手柑素，d-異歐前胡素;e-氧化前胡素;f-水合氧化前胡素;g-佛手柑內酯;h-佛手酚；同時標示其他主要次生代謝物圖5 25 ℃, pH約3.4～3.6紅葡萄柚汁中與6′,7′-EB相關的主要FCs色譜圖Fig.5 Chromatograms of major FCs related to 6′,7′-EB in pH 3.4～3.6 red grapefruit juice at 25 ℃

表2 紅葡萄柚汁中FCs隨時間變化的預測值、實測值及實測修正值的比較Table 2 Comparison of predicted value, measured value and corrected measured value showing FCs changes with timein red grapefruit juice

注：NA，未涉及化學變化，無需計算預測值；ND，未檢出，計算中作0處理；*，利用a物質在果汁和果肉中的提取量之比為換算系數，對果汁實測值作換算修正；-，h和g物質保留時間距a較遠，不符合修正條件，未做修正及相對偏差2計算；對于物質h/g/a，相對偏差1(%)=(果肉提取物實測值-果汁提取物實測值)/果肉提取物實測值× 100；對于物質c/d/b，相對偏差1(%)=(果汁提取物預測值-果汁提取物實測值)/果汁提取物預測值×100，相對偏差2(%)=(果汁提取物預測值-果汁提取物實測修正值)/果汁提取物預測值×100

3 結論

構建在線柱前反應-HPLC-DAD系統(tǒng)，開發(fā)了全套程序化自動監(jiān)測柑橘汁呋喃香豆素側鏈環(huán)氧基酸誘導反應的方法，在鑒定反應產物的同時實現對反應速率的研究，具有精確度高和節(jié)省人力的突出特點。利用該方法研究了模擬柑橘汁體系中6′,7′-環(huán)氧佛手柑素的側鏈反應，發(fā)現其主要通過開環(huán)水合生成6′,7′-二羥佛手柑素，還發(fā)生碳鏈縮短反應產生少量異歐前胡素。動力學研究表明上述反應均符合一級反應規(guī)律，pH越低、反應速率越快。驗證實驗結果顯示，應用模擬體系反應速率常數能夠較準確地計算紅葡萄柚汁中6′,7′-EB及其產物的實時濃度，與修正后測量值的偏差范圍僅為0.8%～5.6%。研究加深了對柑橘FCs采后加工變化的認識，為評估柑橘汁生物活性作用提供了新的工具和途徑。