邵東旭，馬心英，信明浩，王瑞

(菏澤學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，山東 菏澤，274015)

曲酸(kojic acid)于1907年由齋藤在米曲霉釀造醬油中發(fā)現(xiàn)，1912年被命名為曲酸，1924年首次確定曲酸的結(jié)構(gòu)。其化學(xué)名稱為5-羥基-2-羥甲基-4-吡喃酮, 為無色棱柱狀晶體, 易溶于水、醇、丙酮, 微溶于醚、乙酸乙酯、三氯甲烷和吡啶, 不溶于苯[1]。

曲酸產(chǎn)生自微生物的發(fā)酵過程，是一種有機(jī)酸，常見于豆瓣醬、酒類、醋等釀造食品。由于曲酸具有酪氨酶的抑菌能力和抗氧化性，所以常在食品、藥品、化妝品的加工中用作防腐劑、保鮮劑、抗氧化劑等，應(yīng)用較為廣泛[2-5]。曲酸安全性的相關(guān)研究也越來越受到研究人員的關(guān)注, 對其毒性進(jìn)行研究表明，長期食用可損害人體甲狀腺，甚至引發(fā)腫瘤[6-8]。2017年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將曲酸列為3類致癌物。

目前檢測曲酸成熟的方法主要有氣相色譜法[9]、近紅外光譜[10]、高效液相色譜法[6,11-13]、超高效液相色譜法[14]、電化學(xué)方法[15-16]等。與電化學(xué)檢測方法相比，其他幾種方法樣品預(yù)處理繁瑣，操作步驟復(fù)雜，檢測環(huán)境要求嚴(yán)格，費(fèi)用高，而氨基酸特有的官能團(tuán)(如羧基和氨基)聚合在玻碳電極表面后，具有良好的電催化特性，可以改善電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性[17-19]，因此利用氨基酸修飾電極檢測食品中的曲酸有實(shí)際意義。筆者制備了L-瓜氨酸修飾電極，研究了曲酸在該電極上的電化學(xué)行為，并應(yīng)用于食品中曲酸含量分析，方法簡單、快速，準(zhǔn)確度和靈敏度較高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；GCE玻碳電極, 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;三電極體系:飽和甘汞電極電極(SCE)為參比電極，鉑電極(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)為對電極，聚L-瓜氨酸修飾電極(PLC/GCE，自制)為工作電極；SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器，金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；KH-100DB型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；ESJ180-4電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；85-1型恒溫磁力攪拌器，深圳天南海北有限公司；微量進(jìn)樣器,上海高鴿工貿(mào)有限公司。

L-瓜氨酸(AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-3mol/L)；曲酸(AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-3mol/L)；PBS緩沖溶液(由磷酸氫二鈉和檸檬酸配制而成，AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；黃豆醬、味極鮮醬油、陳釀醋，購自超市；實(shí)驗(yàn)過程中用水均為二次蒸餾水。

1.2 聚L-瓜氨酸修飾電極的制備

在涂有Al2O3粉末的濕潤麂皮上將玻碳電極(GCE)的表面打磨拋光后用二次蒸餾水沖洗干凈，依次在超聲波清洗器中用硝酸(1∶1，體積比)、無水乙醇、二次蒸餾水充分清洗30 s左右后，用二次蒸餾水沖洗干凈。再將打磨好的GCE放入1.0×10-4mol/L的L-瓜氨酸(pH=7.0)溶液中，實(shí)驗(yàn)選擇循環(huán)伏安法(CV)在-1.5～2.3 V電位范圍內(nèi)，以10 mV/s的掃描速率掃描6段，聚合完成后取出電極，用二次蒸餾水淋洗電極表面，即制得PLC/GCE。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將三電極體系置于pH=4.0的PBS緩沖溶液中，在0.0～1.5 V電位范圍內(nèi)，以100 mV/s的掃描速率對一定濃度的曲酸溶液進(jìn)行(CV)掃描，根據(jù)測得曲酸的氧化峰電流(ipa)與其濃度(c)所成的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)樣品中曲酸的定量分析。

1.4 樣品預(yù)處理

黃豆醬：稱取已在研缽中充分研磨過的黃豆醬9.5 g，加水稀釋攪勻后，使用真空抽慮泵抽濾，并用二次水沖洗濾紙上的殘?jiān)?遍，將濾液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容后放置冰箱中冷藏，即制得黃豆醬樣品溶液。取9.00 mL上述溶液，加入0.5 mL 0.03 mol/L EDTA 溶液掩蔽醬油樣品中存在的金屬離子，用0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2SO3還原溶液中的氧化性物質(zhì)，10 mL pH=4.0的PBS緩沖溶液，制得樣品待測液備用。

醬油：將醬油樣品用真空抽濾泵抽濾，以過濾不溶性雜質(zhì)，取0.5 mL醬油樣品，加入10 mL pH=4.0的PBS緩沖溶液、0.5 mL 0.03 mol/L EDTA 溶液、0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2SO3和9.5 mL H2O，制得待測液。

醋：向1 mL醋中加入3 mL pH=4.0的PBS緩沖溶液、0.25 mL 0.03 mol/L EDTA 溶液、0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2SO3和2 mL H2O，制得待測液。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚L-瓜氨酸修飾電極的最佳聚合條件

2.1.1L-瓜氨酸溶液pH的選擇

在-1.5～2.2 V的掃描電位范圍、掃描速度為100 mV/s、掃描段數(shù)(n)=10的實(shí)驗(yàn)條件下，改變L-瓜氨酸溶液的pH分別為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0進(jìn)行聚合實(shí)驗(yàn)，分別用不同pH條件下制得的PLC/GCE測定相同濃度曲酸溶液。結(jié)果表明，當(dāng)瓜氨酸溶液pH=7.0時，所制備的修飾電極測定曲酸的氧化峰電流最大，因此選擇pH7.0的L-瓜氨酸溶液做為聚合底液。

2.1.2 聚合掃描段數(shù)(n)的選擇

固定電位范圍為-1.5～2.2 V，掃描速度為100 mV/s，L-瓜氨酸溶液pH=7.0，改變聚合掃描段數(shù)(n)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)n=6時，所制備的修飾電極測定曲酸的氧化峰電流最大，這是因?yàn)殡S著n的增加氨基酸在電極上形成的膜趨于完整，對曲酸的響應(yīng)電流逐漸增大；但隨著n的持續(xù)增加，膜厚增加，電子在膜中阻力變大, 導(dǎo)致響應(yīng)電流降低[20]。故本論文中n選擇6。

2.1.3 聚合掃描速度(v)的選擇

L-瓜氨酸在電極表面的聚合反應(yīng)中，掃描速度會影響膜的平整性、致密性, 直接影響到測定效果[20]。在-1.5～2.2 V的掃描電位、溶液pH=7.0、掃描段數(shù)n=6的實(shí)驗(yàn)條件下，改變聚合電極時的掃描速率v進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)v=10 mV/s時，曲酸在所制備的修飾電極上氧化峰電流最大。

2.1.4 聚合掃描電位的選擇

在溶液pH=7.0、v=10 mV/s、n=6的條件下，分別改變聚合時的掃描高、低電位以確定電位范圍，結(jié)果表明當(dāng)電位范圍在-1.5～2.3 V時，所制備的修飾電極對曲酸催化效果最好。

圖1為在最佳條件下L-瓜氨酸聚合的伏安曲線，由圖1可見，隨著掃描段數(shù)的增加，氧化峰和還原峰電流增加的幅度減小，聚合結(jié)束后可觀察到電極表面有深藍(lán)色的膜存在。

圖1 L-瓜氨酸在玻碳電極上聚合伏安曲線Fig.1 The voltammetry curve of L-citrulline polymeri-zation on glassy carbon electrode

2.2 曲酸在PLC/GCE上的電化學(xué)行為

利用PLC/GCE分別測定了空白溶液、曲酸溶液的CV行為以及GCE測定了曲酸溶液的CV圖，所得循環(huán)伏安曲線如圖2所示。可見PLC/GCE在空白溶液無峰電流響應(yīng)(圖2-a)，說明空白溶液組分對測定無干擾，且聚L-瓜氨酸在空白溶液中不產(chǎn)生氧化還原峰；使用GCE對曲酸溶液進(jìn)行測定時的ipa=1.67 μA，氧化峰電位(Epa)=1.08 V(圖2-b)；而PLC/GCE對同一濃度曲酸溶液進(jìn)行測定時ipa=18.98 μA，Epa=1.07 V(圖2-c)，此時ipa較使用GCE時增加了約11倍，而且峰電位略微負(fù)移，說明聚合在電極表面的聚L-瓜氨酸膜對曲酸的氧化具有電催化作用。此外曲酸在反應(yīng)過程中只產(chǎn)生1個氧化峰，說明曲酸在修飾電極上的反應(yīng)是一不可逆過程。

圖2 PLC/GCE測定空白溶液(a)、GCE測定曲酸溶液(b)、PLC/GCE測定曲酸溶液(c)的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of blank solution determinedby PLC/GCE(a), kojic acid solution determined by GCE(b),kojic acid solution determined by PLC/GCE(c)

2.3 測定曲酸的最佳實(shí)驗(yàn)條件

2.3.1 溶液酸度的影響

保持0～1.5 V的掃描電位、100 mV/s的掃描速度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)不變，測定不同pH的曲酸溶液的ipa。由圖3可見，當(dāng)pH=4.0時，曲酸的ipa最大，故本論文中曲酸溶液的最佳測定pH為4.0。結(jié)果還表明，隨著pH值的升高，曲酸的Epa逐漸負(fù)移，且Epa與pH呈線性關(guān)系(線性關(guān)系如圖4所示)，其方程為：Epa(V)=1.33～0.067 pH(相關(guān)系數(shù)R=0.998 5)，線性方程的斜率為0.067 mV/pH，接近0.059，說明質(zhì)子參與了曲酸在修飾電極表面上的氧化反應(yīng)，且質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)等于電子轉(zhuǎn)移數(shù)，其可能電極反應(yīng)式如下式(1)所示。

自a到g的pH：2.2、3.0、4.0、5.0、 6.0、7.0、8.0圖3 曲酸在PLC/GCE上隨pH變化的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of kojic acid on PLC/GCEwith change of pH

圖4 Epa與pH的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between Epa and pH

2.3.2 掃描速度(v)的選擇

固定曲酸溶液pH=4.0，掃描電位范圍為0.0～1.5 V，討論掃描速度對曲酸ipa的影響。結(jié)果表明，曲酸氧化峰電流隨掃描速度在20～300 mV/s范圍內(nèi)不斷增大而增大，而且ipa與掃描速度呈線性關(guān)系(如圖5所示)，線性方程為：ipa(μA)=5.50+0.056v(mV/s)，R=0.995 2。表明曲酸在聚L-瓜氨酸修飾電極上的電化學(xué)行為是由吸附控制過程的。由圖6可知，當(dāng)掃描速度v=100 mV/s時，氧化峰峰形較好，靈敏度較高，故本文中測定曲酸溶液時的掃描速度為100 mV/s。

圖5 曲酸在PLC/GCE上的ipa隨掃描速度的變化關(guān)系Fig.5 The change of ipaon PLC/GCE with scan rate

自a到o：20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300 mV/s圖6 曲酸在PLC/GCE上隨掃描速度變化的循環(huán)伏安圖Fig.6 cyclic voltammograms of kojic acid with scan rateon PLC/GCE

2.3.3 測定電位范圍的影響

保持曲酸溶液pH=4.0、掃描速度為100 mV/s，討論測定時掃描電位對曲酸的氧化峰電流的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)高電位為1.5 V，低電位0.0 V時所測得的曲酸氧化峰電流值最大，故本論文的最佳掃描電位范圍為0.0～1.5 V。

2.4 工作曲線及方法重現(xiàn)性

在測定曲酸的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用PLC/GCE測定不同濃度曲酸的CV曲線示于圖7。

自a到i: 8、10、20、40、60、80、100、160、280 μmol/L圖7 不同濃度的曲酸在PLC/GCE上的循環(huán)伏安曲線Fig.7 CV curves of kojic acid of different concentration onPLC/GCE

當(dāng)曲酸濃度增加到4.00×10-6mol/L時出現(xiàn)第一個氧化峰，所以本論文中測定曲酸溶液的檢出限為4.00×10-6mol/L。當(dāng)濃度在8.00×10-6～2.80×10-4mol/L的范圍內(nèi)與ipa有良好的線性關(guān)系(如圖8所示)，線性方程為：ipa(A)=1.03×10-6+0.060c(mol/L)，相關(guān)系數(shù)(R)為0.995 5。

c(曲酸)分別為8、10、20、40、60、80、100、160、280 μmol/L圖8 曲酸的濃度與其在PLC/GCE上的氧化峰電流的關(guān)系曲線Fig.8 Curve of the concentration of kojic acid and itsoxidation peak current on PLC/GCE

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

2.6 樣品中曲酸含量測定

用制備的PLC/GCE在測定曲酸溶液的最佳實(shí)驗(yàn)條件下對黃豆醬、醋和醬油樣品待測液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 待測樣品中曲酸的測定(n=3)Table 1 Determination of kojic acid in the sample tobe tested(n=3)

經(jīng)計算黃豆醬中曲酸的含量為0.75 mg/g、醋中曲酸含量為0.029 mg/mL、醬油中曲酸的含量為0.58 mg/mL。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本文制備了PLC/GCE，獲得了修飾電極的最佳制備條件和測定曲酸溶液的最佳實(shí)驗(yàn)條件，用PLC/GCE在最佳實(shí)驗(yàn)條件下對曲酸含量進(jìn)行CV測定。曲酸在8.00×10-6～2.80×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)與其氧化峰電流呈較好的線性關(guān)系，樣品回收率為98.9%～104.2%, 該方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，可用于黃豆醬、醬油和醋樣品中曲酸的測定，建立了測定食品中曲酸含量的新方法。