李慶舒，程琳，鄧紅，張忠，袁莉

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

多酚類化合物是一類苯環(huán)上連接多羥基基團(tuán)結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物的總稱[1]，在植物界中大量存在。多種研究表明，多酚類化合物具有抗氧化、抗變應(yīng)性、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病、抗病毒等一系列生理活性[2]，對(duì)人體健康有多種益處[3-4]。經(jīng)研究證實(shí)，多酚類化合物中多羥基結(jié)構(gòu)能結(jié)合蛋白質(zhì)、多糖、金屬、微生物、生物堿等多種物質(zhì)[5-7]，通過結(jié)合改變其功能性質(zhì)，從而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研究、食品生產(chǎn)、皮革生產(chǎn)、油田化學(xué)等研究領(lǐng)域[8]。近年來，多酚與蛋白質(zhì)的相互作用是多酚化學(xué)以及食品化學(xué)的核心內(nèi)容，已有研究發(fā)現(xiàn)，多酚與蛋白質(zhì)的相互作用方式主要包括二硫鍵、疏水相互作用、氫鍵等，相互作用使得多酚與蛋白質(zhì)都會(huì)發(fā)生不同程度的結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致多酚生物可利用性、蛋白質(zhì)功能特性等的改變[9]，對(duì)兩者在更多領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。

血清白蛋白是體內(nèi)的載體蛋白，多酚等生物小分子被人體攝入后, 首先與蛋白結(jié)合, 然后再發(fā)揮作用[10-11]。因此，了解多酚與蛋白的相互作用對(duì)更好發(fā)揮兩者的生理活性有著重要意義[12]。近年來，已有多種研究表明，茶多酚能與大豆分離蛋白相結(jié)合，從而改善大豆分離蛋白的起泡性與乳化性[13]；姜黃素可與血清白蛋白結(jié)合從而應(yīng)用于臨床藥物配制[14]；花青素與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，可有效減緩自身氧化進(jìn)程，增加自身穩(wěn)定性[15]。

異葒草素(isoorientin, ISO)，由于從葒草中分離得到而命名，別名為3’,4’,5, 7-四羥基-6-C-吡喃葡萄糖基多酚或木犀草素葡萄糖苷[16]，是一種水溶性多酚類物質(zhì)，存在于山楂、竹茹、葫蘆果、蕎麥芽、黃荊和竹葉[17-18]、滿天星等多種植物中。異葒草素還具有多種生理功效，如：通過清除自由基來抵抗氧化損傷，治療糖尿病[19]，抑制炎性疾病，抗腫瘤，抗病毒[20]。

安石榴苷(punicalagin)可從石榴的皮里提取，這種活性成分對(duì)人體有諸多益處，例如：抗氧化[21]、抗炎、抗菌等[22]。安石榴苷可在人體內(nèi)被分解為鞣花酸，鞣花酸具有良好的抗氧化性，另外，鞣花酸(ellagic acid, EA)是一種多酚二內(nèi)酯，具有抗氧化的作用，以及具有抗變異原性、抑制癌細(xì)胞增值的作用[23]。

目前，雖然異葒草素、安石榴苷以及鞣花酸均由于其優(yōu)良的功能活性而引起學(xué)者們廣泛的興趣，但是，并沒有此3種多酚與BSA相互作用的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法、同步熒光光譜法、圓二色譜法等多種測(cè)量方法，通過計(jì)算猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和熱力學(xué)參數(shù)來判斷猝滅類型、作用力類型，研究異葒草素、安石榴苷、鞣花酸與BSA的結(jié)合，為更深入研究多酚類物質(zhì)的體內(nèi)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)提供有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鞣花酸、異葒草素、安石榴苷牛血清蛋白(純度≥97%)，上海永恒生物技術(shù)有限公司；多酚儲(chǔ)備液：稱取一定量的多酚，溶解于甲醇溶液并定容，配制成1.0×10 mmol/L的儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱避光保存，使用時(shí)按需要稀釋；BSA儲(chǔ)備液：稱取一定量的BSA，溶于PBS緩沖液中并定容，配制成0.01 mmol/L的母液，并添加終濃度為0.1 mol/L的NaCl 以維持離子強(qiáng)度；PBS(磷酸鹽緩沖液)：將PBS粉末溶于水中并定容，用酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH至7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min,室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平(BS 224 S),賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；紫外分光光度計(jì)(UV300)，上海儀邁儀器科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋(HH-S4)，北京科偉永興儀器有限公司；熒光分光光度計(jì)(RF-6000)，島津企業(yè)；紅外光譜儀(Tensor27)，德國(guó)布魯克公司；圓二色譜儀(Chirascan)，英國(guó)應(yīng)用光物理公司；熒光分光光度計(jì)(RF-7000)，島津企業(yè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紫外光譜法測(cè)定多酚與BSA的相互作用

取3組10 mL離心管，在離心管中分別加入BSA和不同體積的多酚稀釋溶液， 最后以PBS緩沖溶液定容，使多酚的終濃度分別為0、2、3、4 μmol/L，BSA終濃度為1 μmol/L。充分混勻后，將混合溶液置于25 ℃下恒溫水浴20 min，掃描范圍：200～450 nm。

1.3.2 熒光光譜法測(cè)定多酚與BSA的相互作用

在10 mL離心管中分別加入BSA和不同體積的多酚稀釋液，以PBS緩沖溶液定容，使多酚的終濃度分別為0、2、3、4、5、6、7、8、9和10 μmol/L，BSA終濃度為1 μmol/L。每種多酚配制2組溶液，充分混勻后，將第1組混合溶液于0 ℃恒溫水浴20 min，將第2組混合溶液于25 ℃恒溫水浴20 min，3種多酚的處理方法均是如此。多酚和BSA的檢測(cè)條件如下：激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm，激發(fā)和發(fā)射光譜狹縫寬度均為10 nm, 掃描范圍：300～450 nm的發(fā)射光譜。

1.3.3 圓二色光譜法測(cè)定多酚與BSA的相互作用

取3支10 mL的離心管，在離心管中分別添加 BSA溶液中和不同體積的稀釋過的多酚溶液，使多酚溶液的終濃度分別為0、1、10 μmol/L，BSA終濃度為1.0×10 μmol/L，混合充分后靜置20 min。以相應(yīng)空白溶液為參比，3種多酚的處理方法均是如此，它們的測(cè)量條件如下：分辨率1 nm，狹縫1 nm，步長(zhǎng)1 nm，靈敏度為5 m°/cm。

1.3.4 紅外光譜法測(cè)定多酚與BSA的相互作用

于10 mL離心管中，分別配制1 μmol/L的BSA溶液、10 μmol/L的多酚溶液，以及BSA多酚混合溶液，使混合溶液的BSA終濃度為1 μmol/L、多酚終濃度為10 μmol/L，室溫下靜置20 min，以KBr為空白，利用液膜法分別記錄以上溶液的紅外光譜，分辨率為4 cm-1，采集范圍為1 000～2 000 cm-1，3種多酚的處理方法相同。

1.3.5 同步熒光法測(cè)定多酚與BSA的相互作用

BSA和多酚溶液作用的處理方法同1.3.2，測(cè)量時(shí)需設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm，Δλ分別為15和60 nm，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜狹縫寬度均為10 nm，掃描范圍：300～450 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜法研究3種多酚與BSA的相互作用

蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸殘基約在280 nm具有吸收峰，蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，可用紫外光譜法研究小分子與BSA如何相互作用[24]。

本試驗(yàn)固定BSA的濃度，觀察不同濃度多酚與BSA的紫外吸收光譜，結(jié)果如圖1所示。隨著異葒草素濃度的增加，BSA的吸收峰分別從273 nm移至267 nm，發(fā)生藍(lán)移，隨著安石榴苷、鞣花酸濃度的增加，BSA的吸收峰分別從273 nm移至275和274 nm，有微弱紅移，說明3種多酚都改變了BSA的構(gòu)象。因?yàn)閯?dòng)態(tài)猝滅不改變蛋白質(zhì)的吸收光譜，而靜態(tài)猝滅可以改變[25]。因此，結(jié)果說明異葒草素、安石榴苷、鞣花酸與BSA相互作用后形成了新的復(fù)合物，改變了BSA的吸收光譜，且異葒草素、安石榴苷、鞣花酸對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。

a-異葒草素+BSA;b-安石榴苷+BSA;c-鞣花酸+BSA圖1 異葒草素、安石榴苷、鞣花酸與BSA結(jié)合的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet-visible spectrum of interaction between isoorientin, punicalagin, ellagic acid and BSA

2.2 熒光光譜法研究3種多酚與BSA的相互作用

蛋白質(zhì)分子中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)3種芳香族氨基酸殘基能夠吸收紫外光并發(fā)射熒光，當(dāng)發(fā)生分子相互作用、激發(fā)態(tài)反應(yīng)、分子重排、能量轉(zhuǎn)移、形成基態(tài)復(fù)合物以及碰撞猝滅時(shí)，熒光發(fā)色團(tuán)的熒光強(qiáng)度下降，因此，研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)常用熒光光譜法[26]。本研究對(duì)一系列含有相同濃度BSA和不同濃度多酚的溶液進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。BSA溶液在約340 nm處有一發(fā)射峰，但隨著多酚濃度的增加，BSA發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度在0 ℃和25 ℃兩種處理溫度下均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，這種熒光猝滅現(xiàn)象，說明3種多酚和BSA均發(fā)生相互作用，并形成弱熒光的多酚-BSA復(fù)合物。

2.2.1 猝滅類型的確定

靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅2種猝滅機(jī)制是多酚等小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)的主要猝滅機(jī)制，二者的區(qū)別在于對(duì)溫度和黏度的依賴性不同。靜態(tài)猝滅是指多酚與BSA形成無熒光或弱熒光的復(fù)合物而導(dǎo)致的，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而降低；而動(dòng)態(tài)猝滅是多酚和蛋白質(zhì)分子之間相互碰撞引起的，猝滅常數(shù)隨著溫度升高而增大。分析多酚等小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)的熒光猝滅機(jī)制時(shí)采用Stern-Volmer方程[27]：

F0/F=1+KsvQ=1+Kqτ0Q

(1)

式中:F0和F，代表異葒草素等多酚不存在時(shí)和濃度為Q時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度;Ksv，動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)；Q，多酚的濃度；Kq，猝滅速率常數(shù)；τ0，猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的平均壽命，約為10-8s[28]。

a-異葒草素+BSA(0 ℃);b-異葒草素+BSA(25 ℃); c-安石榴苷+BSA(0 ℃);d-安石榴苷+BSA(25 ℃)e-鞣花酸+BSA(0 ℃);f-鞣花酸+BSA(25 ℃)圖2 三種多酚與牛血清蛋白結(jié)合的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of three polyphenols combined with BSA注：多酚濃度從0到10依次為0、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μmol/L，BSA濃度為1 μmol/L

根據(jù)數(shù)據(jù)繪制不同溫度、不同多酚條件下的Stern-Volmer圖，如圖3所示。

a-異葒草素+BSA;b-安石榴苷+BSA;c-鞣花酸+BSA圖3 0、25℃下3種多酚和牛血清蛋白相互作用的Stern-Volmer圖Fig.3 Stern-Volmer figures of three polyphenols under 0,25 ℃ and bovine serum albumin interaction

由圖3可見，在3種多酚作用范圍內(nèi)的曲線具有良好的線性關(guān)系。由表1可見，隨著處理溫度的升高，Ksv值卻隨之下降，提示3種多酚和BSA相互作用的猝滅機(jī)制可能均是靜態(tài)猝滅而不是動(dòng)態(tài)猝滅。另外，各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010mol/(L·s)[29]，而表1顯示，0和25 ℃下BSA的猝滅速率常數(shù)Kq分別為3.590×1012、1.277×1012、22.241×1012、18.244×1012、58.421×1012和40.605 ×1012L/(mol·s)，均遠(yuǎn)高于2.0×1010mol/(L·s)。該結(jié)果進(jìn)一步揭示，異葒草素、安石榴苷以及鞣花酸對(duì)BSA的熒光猝滅均是靜態(tài)猝滅。

表1 三種多酚和牛血清白蛋白相互作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants for theinteraction of ISO, punicalagin, EA with BSA

2.2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算

上述結(jié)果表明異葒草素、安石榴苷、鞣花酸與牛血清蛋白的相互作用機(jī)制為靜態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅現(xiàn)象符合雙對(duì)數(shù)公式，可通過雙對(duì)數(shù)公式進(jìn)一步來分析靜態(tài)猝滅：

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlgQ

(2)

式中：Ka，結(jié)合常數(shù)，n結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[30]。

根據(jù)數(shù)據(jù)繪制雙對(duì)數(shù)圖，如圖4所示。Ka和n值分別通過圖4中曲線的截距和斜率計(jì)算，表2為不同處理溫度下的Ka和n值。由表2可知，異葒草素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)n接近2，說明在實(shí)驗(yàn)濃度下，它與BSA的結(jié)合比例約為 2∶1，安石榴苷、鞣花酸與BSA的結(jié)合位點(diǎn)n均接近1，并且?guī)缀醪皇軠囟鹊挠绊懀鼈兣cBSA的結(jié)合比例約為 1∶1，并且3種多酚與牛血清蛋白作用的結(jié)合常數(shù)Ka值以108為數(shù)量級(jí)，均遠(yuǎn)大于104數(shù)量級(jí)，說明異葒草素、安石榴苷、鞣花酸與牛血清蛋白之間均具有較強(qiáng)的結(jié)合作用。

a-異葒草素+BSA;b-安石榴苷+BSA;c-鞣花酸+BSA圖4 0、25 ℃下3種多酚和牛血清蛋白相互作用的雙對(duì)數(shù)圖Fig.4 Double logarithmic figures of three polyphenols under 0，25 ℃ and bovine serumalbumin interaction

表2 多酚與牛血清白蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)Table 2 Binding constants and binding sites for theinteraction of ISO，punicalagin, EA with BSA

2.2.3 熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型的計(jì)算

多酚等小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)的作用力類型主要由自由能變、焓變和熵變等熱力學(xué)參數(shù)來確定。熱力學(xué)參數(shù)自由能變(ΔG)、焓變(ΔH)和熵變(ΔS)可通過公式(3)、公式(4)進(jìn)行計(jì)算：

(3)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKa

(4)

式中:T1溫度下的結(jié)合常數(shù)為Ka1;T2溫度下的結(jié)合常數(shù)為Ka2;R為氣體常數(shù)。

由公式(3)、(4)可求出ΔG、ΔH和ΔS，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制表3。

表3 多酚與牛血清白蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for the interactionof ISO, punicalagin, EA with BSA

研究表明[13]，當(dāng)ΔH>0且ΔS>0時(shí)主要作用力為疏水作用力；當(dāng)ΔH<0且ΔS>0時(shí)靜電引力起主要作用；當(dāng)ΔH<0且ΔS<0時(shí)氫鍵和范德華力起主要作用[31-32]。

由表3可見，在同一溫度下，ΔG值由小到大的多酚依次為異葒草素、鞣花酸、安石榴苷；不同溫度下ΔG均小于0，表明異葒草素、安石榴苷、鞣花酸與BSA之間的相互作用均是自發(fā)進(jìn)行的；3種多酚與BSA相互作用的ΔH和ΔS均為正值，提示此3種多酚與BSA之間的結(jié)合主要是吸熱和熵驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，并且主要作用力為疏水作用力。

2.3 圓二色譜法研究3種多酚與BSA的相互作用

圓二色譜常用于研究多酚等小分子與蛋白質(zhì)相互作用。BSA的紫外區(qū)段(190～240 nm)圓二色譜反映了主鏈構(gòu)象[33]。從圖5可以看出，BSA中加入不同濃度的異葒草素、安石榴苷、鞣花酸后，BSA在208 nm和222 nm 處吸收峰的振幅有不同程度的增大，但兩處負(fù)吸收峰的形狀和波峰位置均未發(fā)生明顯變化。說明異葒草素、安石榴苷、鞣花酸與BSA的相互作用均可導(dǎo)致BSA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

a-異葒草素+BSA;b-安石榴苷+BSA;c-鞣花酸+BSA圖5 三種多酚分別與BSA相互作用的圓二色譜圖Fig.5 Circular dichroism spectra of three polyphenols interacting with BSA, respectively注：多酚濃度依次為0、1、10 μmol/L，BSA濃度為1 μmol/L

2.4 紅外光譜研究3種多酚與BSA的相互作用

a-異葒草素+BSA;b-安石榴苷+BSA;c-鞣花酸+BSA圖6 三種多酚與BSA相互作用的紅外光譜圖Fig.6 FTIP spectrum of three polyphenols interacting with BSA注：多酚濃度為10 μmol/L，BSA濃度為1 μmol/L

由圖6可以看出，異葒草素與BSA結(jié)合后，酰胺Ⅰ帶的峰位置由1 684 cm-1紅移至1 686 cm-1，酰胺Ⅱ帶的峰位置由1 572 cm-1紅移至1 574 cm-1；安石榴苷與BSA結(jié)合后，酰胺Ⅰ帶的峰位置由1 661 cm-1藍(lán)移至1 659 cm-1，酰胺Ⅱ帶的峰位置由1 531 cm-1藍(lán)移至1 529 cm-1；鞣花酸與BSA結(jié)合后，酰胺Ⅰ帶的峰位置由1 661 cm-1藍(lán)移至1 657 cm-1，酰胺Ⅱ帶的峰位置由1 531cm-1藍(lán)移至1 529cm-1。上述酰胺帶峰位置的變化說明多酚與BSA發(fā)生相互作用，導(dǎo)致BSA構(gòu)象的改變。

2.5 同步熒光光譜法研究3種多酚與BSA的相互作用

BSA的構(gòu)象和發(fā)色團(tuán)微環(huán)境的變化可以通過同步熒光光譜來反映。當(dāng)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)差Δλ分別為15、60 nm時(shí)，分別表示的是酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)殘基的熒光特征。同時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向或者短波方向移動(dòng)，即紅移或者藍(lán)移，說明氨基酸殘基周圍微環(huán)境極性增強(qiáng)或疏水性增強(qiáng)[35]。

根據(jù)數(shù)據(jù)繪制異葒草素等多酚與BSA的同步熒光光譜圖，如圖7所示。由圖7可見，隨著異葒草素、安石榴苷、鞣花酸濃度的增大，Tyr和Trp殘基的熒光強(qiáng)度均有不同程度的下降。加入異葒草素后，Δλ為15 nm的這組最大發(fā)射波長(zhǎng)從 285 nm移至286 nm，Δλ為60 nm的這組最大發(fā)射波長(zhǎng)沒有發(fā)生明顯改變，說明異葒草素更接近Tyr 殘基，并導(dǎo)致Tyr殘基周圍極性增加，疏水性降低；加入安石榴苷、鞣花酸后，Tyr殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)沒有發(fā)生明顯改變，說明其對(duì)Tyr殘基的影響不大，Trp殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別從278 nm移至281 nm、280 nm移至281nm，發(fā)生微弱紅移，表明安石榴苷、鞣花酸更接近于Trp殘基，并導(dǎo)致Trp殘基周圍極性增加，疏水性降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與3種多酚結(jié)合后BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

a-BSA+異葒草素(Δλ=15 nm); b-BSA+異葒草素(Δλ=60 nm); c-BSA+安石榴苷(Δλ=15 nm);d-BSA+安石榴苷(Δλ=60 nm); e-BSA+鞣花酸(Δλ=15 nm); f-BSA+鞣花酸(Δλ=60 nm)圖7 三種多酚BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of three polyphenols interacting with BSA注：多酚濃度從0到10依次為0、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μmol/L，BSA濃度為1 μmol/L

3 結(jié)論

(1)異葒草素、安石榴苷、鞣花酸均可與BSA結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅，猝滅過程以靜態(tài)猝滅為主；3種多酚與BSA相互作用后，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

(2)異葒草素與BSA的結(jié)合比例約為 2∶1；安石榴苷、鞣花酸與BSA的結(jié)合比例約為 1∶1。

(3)異葒草素、安石榴苷、鞣花酸與BSA之間的相互作用均是自發(fā)進(jìn)行的，3種多酚與BSA之間的結(jié)合主要是吸熱和熵驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，并且主要作用力可初步確定為疏水作用力。

(4)異葒草素使BSA的酪氨酸殘基周圍極性稍有增加，使得疏水性有降低的趨勢(shì)；而安石榴苷、鞣花酸使BSA的色氨酸殘基周圍極性稍有增加，且疏水性有降低的趨勢(shì)。