周新麗，申炳陽，高麗娟，孔兵，葉嘉明,3*

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093) 2(浙江清華長(zhǎng)三角研究院 分析測(cè)試中心，浙江 嘉興，314006)3(國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心 應(yīng)用技術(shù)合作中心，浙江 嘉興，314006)

近年來，廉價(jià)肉冒充牛羊肉、掛鵝頭賣鴨肉等肉類及肉制品以次充好事件不斷發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的權(quán)益。摻假肉類及肉制品不僅擾亂了正常的市場(chǎng)秩序，而且存在導(dǎo)致特殊體質(zhì)人群發(fā)生過敏反應(yīng)的潛在危險(xiǎn)，對(duì)社會(huì)誠(chéng)信、人們身心健康造成了極大的困擾[1-3]。針對(duì)日益繁多的肉類及肉制品摻假現(xiàn)象，如何建立快速、準(zhǔn)確有效的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法，已經(jīng)成為肉類及肉制品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前，用于動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法主要有常規(guī)理化檢驗(yàn)技術(shù)、基于蛋白質(zhì)的免疫分析技術(shù)和基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)[4-8]。其中，分子生物學(xué)技術(shù)中的重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(recombinase-aid amplification, RAA)技術(shù)，以其操作簡(jiǎn)單、恒溫條件下擴(kuò)增、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高等特點(diǎn)[9-11]，成為動(dòng)物源性成分快速檢測(cè)最有效的方法之一，但是核酸檢測(cè)一般都存在環(huán)境中核酸污染的問題，氣溶膠的擴(kuò)散容易造成后續(xù)樣本檢測(cè)出現(xiàn)假陽性。相比之下，使用微流控技術(shù)能夠很好地解決污染問題[12]，微流控芯片中環(huán)境的封閉性，使得外界核酸難以進(jìn)入芯片內(nèi)污染，而芯片內(nèi)各腔室的獨(dú)立分布有效地隔斷了內(nèi)部污染情況，將核酸污染降低到了最低程度；同時(shí)微流控芯片技術(shù)還具有試劑消耗量低、分析速度快、檢測(cè)通量高、設(shè)備體積小、自動(dòng)化程度高、非專業(yè)人員使用、成本低等優(yōu)點(diǎn)[13-15]，特別適合于動(dòng)物源性成分的快速檢測(cè)。

本文將離心式微流控芯片和RAA技術(shù)相結(jié)合，使用一次性的高聚物微流控芯片，配合便攜式微流控速測(cè)儀，用于牛、羊、豬、鴨和雞源性成分的快速檢測(cè)，并設(shè)計(jì)了一套密封蓋片和芯片托盤裝置，旨在實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源性成分的多樣本、多指標(biāo)快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芯片材料：光學(xué)級(jí)聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)板材，蘇州揚(yáng)清芯片科技有限公司；光學(xué)級(jí)雙面膠(厚0.1 mm)，杭州霆科生物科技有限公司。

肉類樣品：豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、雞肉，購(gòu)于杭州市蕭山區(qū)農(nóng)貿(mào)超市。

試劑：豬源性成分分子檢測(cè)試劑盒、牛源性成分分子檢測(cè)試劑盒、羊源性成分分子檢測(cè)試劑盒、鴨源性成分分子檢測(cè)試劑盒、雞源性成分分子檢測(cè)試劑盒(包含引物、裂解液、緩沖液 A、緩沖液 B)，杭州眾測(cè)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YoungLaser-V12型二氧化碳激光芯片雕刻機(jī)、蘇州揚(yáng)清芯片科技有限公司；微流控芯片縫合機(jī)，蘇州揚(yáng)清芯片科技有限公司；YQ-620C型超聲波清洗機(jī)，上海易凈超聲波儀器有限公司；DW系列超低溫保存箱(-86 ℃)，海爾生物醫(yī)療公司；Scientz-N型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司；FA-1604電子天平，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)(18 MΩ)，美國(guó)Millipore公司；MF-52型倒置熒光顯微鏡，廣州明美光電技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)原理

采用RAA技術(shù)來檢測(cè)分析動(dòng)物源性成分。RAA技術(shù)原理[16]為在37 ℃恒溫下，重組酶和引物緊密結(jié)合成酶與引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到同源序列時(shí)，單鏈DNA結(jié)合蛋白輔助打開DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)DNA聚合酶催化形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，并用熒光探針(熒光基團(tuán)為FAM)標(biāo)記目的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為490 nm，檢測(cè)光波長(zhǎng)為520 nm，擴(kuò)增陽性的肉類樣品會(huì)產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肉類樣品的半定量檢測(cè)分析。

1.3.2 芯片的設(shè)計(jì)與制作

如圖1-a所示，設(shè)計(jì)的扇形微流控芯片由3層PMMA基片組成，蓋板、通道層、底板的厚度分別為0.5、2.0、0.5 mm。芯片主要由進(jìn)樣孔、進(jìn)樣區(qū)、儲(chǔ)液區(qū)、檢測(cè)區(qū)(同時(shí)包含陽性質(zhì)控區(qū)、陰性質(zhì)控區(qū))、微通道、鋸齒形通道和通氣孔構(gòu)成(圖1-b)，其中，進(jìn)樣區(qū)、儲(chǔ)液區(qū)、檢測(cè)區(qū)的體積分別為140、20、20 μL。

a-立體結(jié)構(gòu);b-平面結(jié)構(gòu);1-進(jìn)樣孔；2-進(jìn)樣區(qū)；3-儲(chǔ)液區(qū)；4a-陽性質(zhì)控區(qū)；4b-牛肉檢測(cè)區(qū)；4c-羊肉檢測(cè)區(qū)；4d-豬肉檢測(cè)區(qū)；4e-鴨肉檢測(cè)區(qū)；4f-雞肉檢測(cè)區(qū)；4g-陰性質(zhì)控區(qū)；5-微通道；6-鋸齒形通道；7-通氣孔圖1 扇形微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of fan-shaped microfluidicchip structure

芯片的加工制作過程如下[17]：首先，用SolidWorks軟件設(shè)計(jì)微流控芯片的立體結(jié)構(gòu)，通過結(jié)構(gòu)分割劃分芯片為3層結(jié)構(gòu)——底板、通道層、蓋板，并使用AutoCAD軟件繪制芯片各層的幾何圖案；其次，通過數(shù)據(jù)傳輸將設(shè)計(jì)好的芯片各層幾何圖案參數(shù)傳送至CO2激光雕刻機(jī)，采用CO2激光直寫法直接在PMMA基片上加工池體結(jié)構(gòu)和微通道，形成通道層基片，同時(shí)切割獲得底板、蓋板基片；最后，將刻有微通道和池體結(jié)構(gòu)的PMMA基片置于含去離子水的超聲波清洗機(jī)中清洗并吹干，之后與底板、蓋板基片使用雙面膠進(jìn)行常溫鍵合，即得到一次性的PMMA微流控芯片。

1.3.3 密封蓋片及芯片托盤裝置的設(shè)計(jì)

為了避免環(huán)境中的核酸分子進(jìn)入扇形微流控芯片內(nèi)影響檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了1套配合扇形微流控芯片使用的密封蓋片。如圖2-a所示，密封蓋片主要由壓蓋、卡扣和疏水透氣膜構(gòu)成，其中，疏水透氣膜只允許芯片與外界進(jìn)行通氣，但不允許溶液通過。

如圖2-b所示，芯片托盤裝置上集成了5個(gè)可拆卸的扇形微流控芯片，檢測(cè)時(shí)可以自由選擇所放置扇形微流控芯片的個(gè)數(shù)，每次可同時(shí)檢測(cè)5個(gè)樣本，每個(gè)樣本可同時(shí)檢測(cè)5種指標(biāo)，適用于動(dòng)物源性成分的多樣本、多指標(biāo)檢測(cè)。

a-密封蓋片;b-芯片托盤裝置;1-壓蓋；2-卡扣；3-疏水透氣膜圖2 密封蓋片及芯片托盤裝置Fig.2 Sealing cover and chip tray

1.3.4 芯片上的試劑預(yù)存儲(chǔ)

扇形微流控芯片鍵合之前，采用真空冷凍干燥法將所需試劑預(yù)先固定在芯片檢測(cè)區(qū)中[18]，具體操作方法如下：在圖1-b所示芯片的檢測(cè)區(qū)4b～4f中依次加入20 μL豬引物、牛引物、羊引物、鴨引物、雞引物溶液，分別用于豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、雞肉中肉源性成分的快速檢測(cè)；同時(shí)，在陽性質(zhì)控區(qū)4a、陰性質(zhì)控區(qū)4 g中分別加入20 μL陽性質(zhì)控試劑(含引物及其模板DNA片段)和超純水，各自作為實(shí)驗(yàn)的陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。質(zhì)控僅作為芯片上判讀結(jié)果是否有效的參考，不計(jì)入后面核酸擴(kuò)增曲線研究。將加入試劑的芯片在超低溫保存箱-80 ℃下預(yù)凍30 min，之后置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥2 h，獲得預(yù)存儲(chǔ)試劑的微流控芯片。

1.3.5 便攜式微流控速測(cè)儀的搭建

便攜式微流控速測(cè)儀如圖3-a所示，其基本組成包括恒溫控制平臺(tái)、流體控制模塊、光電檢測(cè)模塊和數(shù)據(jù)處理模塊等(3-b)。其中，流體控制模塊包括電機(jī)和芯軸；光電檢測(cè)模塊由LED光源、濾光片組和光電池感應(yīng)器組成。便攜式微流控速測(cè)儀的運(yùn)行過程如下：首先，流體控制模塊驅(qū)動(dòng)電機(jī)并帶動(dòng)微流控芯片沿中心位置轉(zhuǎn)動(dòng)，一定時(shí)間后轉(zhuǎn)動(dòng)停止；其次，微流控芯片在恒溫控制平臺(tái)的作用下逐漸達(dá)到設(shè)定溫度；最后，LED光源將會(huì)與芯片上特定的檢測(cè)區(qū)對(duì)準(zhǔn)，檢測(cè)區(qū)的熒光基團(tuán)經(jīng)激發(fā)后射出一定波長(zhǎng)的檢測(cè)光，通過光電池感應(yīng)器讀取信號(hào)，再經(jīng)過數(shù)據(jù)處理模塊，得到檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度。

a-速測(cè)儀外觀圖;b-速測(cè)儀系統(tǒng)組成示意圖;1-微流控芯片；2-恒溫控制平臺(tái)；3-芯軸；4-電機(jī)；5-濾光片組；6-LED光源；7-光電池感應(yīng)器圖3 便攜式微流控速測(cè)儀Fig.3 Portable microfluidic tachymeter

1.3.6 芯片上的流體控制

微流控芯片的基本特征是集成多種操作單元于整體可控的微小平臺(tái)上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)微量液體在芯片內(nèi)部的精密、可控轉(zhuǎn)移[19]。圖4顯示了扇形微流控芯片上的流體驅(qū)動(dòng)過程。首先，用移液槍將待檢液加入進(jìn)樣區(qū)(步驟1)；其次，待檢液等量分成7份轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液區(qū)(步驟2)；最后，儲(chǔ)液區(qū)的待檢液進(jìn)入檢測(cè)區(qū)，進(jìn)行核酸擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)(步驟3)，從而完成芯片上的流體驅(qū)動(dòng)過程。

1.3.7 離心式微流控芯片系統(tǒng)的考察

1.3.7.1 試劑準(zhǔn)備

模板DNA的提取：稱取肉類樣品50～100 mg，剪碎，置于含有裂解液500 μL的1.5 mL離心管中，上下顛倒混勻，70 ℃下加熱10 min，待冷卻后12 000 r/min離心2 min，吸取上清液作為模板DNA，提取的模板DNA作為質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%的源性成分DNA。

圖4 扇形微流控芯片上的流體驅(qū)動(dòng)過程Fig.4 Fluid-driven process onfan-shaped microfluidic chips

反應(yīng)液的制備：微流控芯片設(shè)計(jì)的進(jìn)樣體積是140 μL，取5.6 μL模板DNA于0.5 mL離心管中，先后加入127.4 μL緩沖液A、7 μL緩沖液 B，渦旋，離心，靜置待用。

1.3.7.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將不同肉類樣品提取的模板DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，設(shè)計(jì)5個(gè)稀釋度，用超純水分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、10%、1%、0.1%、0.01%的豬、牛、羊、鴨、雞源性DNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察，以對(duì)應(yīng)梯度稀釋的DNA為模板制備反應(yīng)液。取140 μL反應(yīng)液加入芯片進(jìn)樣區(qū)，將扇形微流控芯片配合托盤裝置放入便攜式微流控速測(cè)儀內(nèi)，每1 min采集1次動(dòng)物源性成分檢測(cè)區(qū)的熒光值，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制5種動(dòng)物源性成分的核酸擴(kuò)增曲線。若動(dòng)物源性成分對(duì)應(yīng)檢測(cè)區(qū)的核酸擴(kuò)增曲線為直線或不規(guī)則的“S”型曲線，結(jié)果判讀為陰性；若核酸擴(kuò)增曲線為規(guī)則的“S”型曲線，結(jié)果判讀為陽性。以產(chǎn)生“S”形擴(kuò)增曲線的最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為該動(dòng)物源性成分的檢出限，將擴(kuò)增結(jié)束后的扇形微流控芯片置于熒光顯微鏡下判讀結(jié)果，檢測(cè)區(qū)有綠色熒光的為陽性，檢測(cè)區(qū)無綠色熒光的為陰性，并與核酸擴(kuò)增曲線的分析結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.7.3 特異性實(shí)驗(yàn)

為了最大程度考察方法的特異性，對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%的豬、牛、羊、鴨、雞源性DNA進(jìn)行單獨(dú)考察。取140 μL反應(yīng)液加入芯片進(jìn)樣區(qū)，將扇形微流控芯片配合托盤裝置放入便攜式微流控速測(cè)儀內(nèi)，每1 min采集1次動(dòng)物源性成分檢測(cè)區(qū)的熒光值，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制5種動(dòng)物源性成分的核酸擴(kuò)增曲線。在一定時(shí)間內(nèi)，考察的具體源性成分只出現(xiàn)1條“S”型核酸擴(kuò)增曲線，且“S”型核酸擴(kuò)增曲線來自于源性成分對(duì)應(yīng)檢測(cè)區(qū)，而其他檢測(cè)區(qū)的核酸擴(kuò)增曲線為直線或不規(guī)則的“S”型曲線，則說明該源性成分的特異性良好，無交叉反應(yīng)；若核酸擴(kuò)增曲線未呈現(xiàn)上述特征，則說明該源性成分的特異性較差，存在交叉反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯片上的流體控制

如圖5-A所示，芯片上定量加樣140 μL時(shí)，待檢液充滿整個(gè)進(jìn)樣區(qū)；當(dāng)流體控制模塊處于低速(介于500～700 r/min，逆時(shí)針)運(yùn)行狀態(tài)時(shí)，待檢液等量分成7份轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液區(qū)，但無法突破儲(chǔ)液區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間的“毛細(xì)管閥”作用(圖5-b)；當(dāng)流體控制模塊處于高速(大于1 800 r/min，逆時(shí)針)運(yùn)行狀態(tài)時(shí)，儲(chǔ)液區(qū)的待檢液將完全突破“毛細(xì)管閥”作用，進(jìn)入并充滿檢測(cè)區(qū)(圖5-c)。確定微流控芯片上的流體控制參數(shù)為：一次離心轉(zhuǎn)速600 r/min，二次離心轉(zhuǎn)速1 900 r/min。

a-加樣狀態(tài);b-低速離心狀態(tài);c-高速離心狀態(tài)圖5 不同下狀態(tài)下的微流控芯片F(xiàn)ig.5 Microfluidic chips under different states

2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

圖6顯示了微流控芯片中5種動(dòng)物源性成分的靈敏度擴(kuò)增曲線。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、10%、1%、0.1%、0.01%的動(dòng)物源性成分待檢液中，以產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線的最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為該動(dòng)物源性成分的檢出限。

如圖6-a所示，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線的特征，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、10%、1%的牛源性成分?jǐn)U增曲線呈現(xiàn)“S”型，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.01%的牛源性成分?jǐn)U增曲線為直線，說明最低可檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛源性成分。牛源性成分核酸擴(kuò)增曲線的起峰時(shí)間在5～8 min、25 min時(shí)核酸擴(kuò)增結(jié)束，表明離心式微流控芯片系統(tǒng)可以在25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)牛源性成分的快速檢測(cè)。同理，如圖6-b，6-c，6-d，6-e所示，羊、豬、鴨、雞源性成分的檢出限分別為1%、0.1%、0.1%、1%，離心式微流控芯片系統(tǒng)可以在25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)5種動(dòng)物源性成分的快速檢測(cè)。

a-牛源性;b-羊源性;c-豬源性;d-鴨源性;e-雞源性圖6 微流控芯片中5種動(dòng)物源性成分的靈敏度擴(kuò)增曲線Fig.6 Sensitivity curves of five animal derived components in microfluidic chips

為了確認(rèn)離心式微流控芯片系統(tǒng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，將擴(kuò)增結(jié)束的微流控芯片置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。根據(jù)檢測(cè)區(qū)是否有綠色熒光判讀結(jié)果，牛、羊、豬、鴨、雞源性成分的檢出限分別為1%、1%、0.1%、0.1%、1%，與便攜式微流控速測(cè)儀檢測(cè)的結(jié)果一致，這表明離心式微流控芯片系統(tǒng)的準(zhǔn)確度較高。

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

圖7顯示了微流控芯片中5種動(dòng)物源性成分的特異性擴(kuò)增曲線。如圖7-a所示，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線的特征，在30 min內(nèi)，考察的牛源性成分只出現(xiàn)1條“S”型核酸擴(kuò)增曲線，且該“S”型核酸擴(kuò)增曲線來自于牛肉檢測(cè)區(qū)，而羊、豬、鴨、雞肉檢測(cè)區(qū)的核酸擴(kuò)增曲線為直線，則說明微流控芯片對(duì)牛源性成分檢測(cè)的特異性良好，無交叉反應(yīng)；同理，如圖7-b～7-e所示，考察的羊、豬、鴨、雞源性成分均符合特異性良好的規(guī)定。綜上所述，微流控芯片方法的特異性良好，可以用來進(jìn)行5種動(dòng)物源性成分的同時(shí)檢測(cè)。

a-牛源性;b-羊源性;c-豬源性;d-鴨源性;e-雞源性圖7 微流控芯片中5種動(dòng)物源性成分的特異性擴(kuò)增曲線Fig.7 Specificity curves of five animal derived components in microfluidic chips

2.4 方法對(duì)比

將一些商品化的核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀與本文提出的離心式微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比。從表1可以看出，離心式微流控芯片系統(tǒng)的反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，能在37 ℃恒溫下快速擴(kuò)增目的基因；污染少，微流控芯片中環(huán)境的封閉性使得外界核酸難以進(jìn)入芯片內(nèi)污染，而芯片內(nèi)各腔室的獨(dú)立分布有效地隔斷了內(nèi)部污染情況；檢測(cè)效率高，每次可同時(shí)檢測(cè)5個(gè)樣本，每個(gè)樣本可同時(shí)檢測(cè)5種指標(biāo)；分析速度快，一般的核酸快速檢測(cè)時(shí)間為1 h及以上，而離心式微流控芯片系統(tǒng)的檢測(cè)時(shí)間僅為30 min。

表1 微流控芯片系統(tǒng)與商品化核酸擴(kuò)增儀的對(duì)比Table 1 Comparison of microfluidic chip system and commercial nucleic acid amplification instrument

3 結(jié)論

本文基于RAA技術(shù)檢測(cè)原理，設(shè)計(jì)了用于牛、羊、豬、鴨、雞源性成分快速檢測(cè)的扇形微流控芯片和配套使用的密封蓋片、芯片托盤裝置。同時(shí)，搭建了芯片配套使用的便攜式微流控速測(cè)儀，其基本組成包括恒溫控制平臺(tái)、流體控制模塊和光電檢測(cè)模塊等。扇形微流控芯片經(jīng)便攜式微流控速測(cè)儀的流體驅(qū)動(dòng)測(cè)試后，得到了流體的控制參數(shù)：一次離心轉(zhuǎn)速600 r/min，二次離心轉(zhuǎn)速1 900 r/min。之后采用真空冷凍干燥技術(shù)，在微流控芯片上預(yù)存儲(chǔ)牛、羊、豬、鴨、雞的引物試劑，獲得了預(yù)存儲(chǔ)試劑的微流控芯片。對(duì)離心式微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行考察，建立了半定量檢測(cè)牛、羊、豬、鴨、雞源性成分的方法。確定了牛、羊、豬、鴨、雞源性成分的檢出限分別為1%、1%、0.1%、0.1%、1%，離心式微流控芯片系統(tǒng)可以在25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)5種動(dòng)物源性成分的快速檢測(cè)，檢測(cè)的特異性良好，無交叉反應(yīng)。