張國(guó)文，石文麗，朱 苗

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

酪氨酸酶(Tyrosinase，TY)又稱多酚氧化酶，是黑色素合成和果蔬褐變的關(guān)鍵酶[1]，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，TY常見于黑色素細(xì)胞中，能催化產(chǎn)生黑色素，黑色素可以被分泌到表皮和毛發(fā)的角質(zhì)細(xì)胞中，使其著色[2]。在人體內(nèi)TY代謝異常則會(huì)引起部分色素沉著性皮膚病，如黃褐斑、雀斑、老年斑等，同時(shí)，還與人類的帕金森癥、黑色素瘤和白化病等疾病的發(fā)生與治療有直接關(guān)聯(lián)。

歐前胡素(Imperatorin，圖1)屬于6，7-呋喃香豆素類，在含有歐前胡素的植物中，傘形科植物的種類最多，包括蛇床子、白芷、防風(fēng)等[3]。歐前胡素安全范圍較大、毒性較易控制[4]，主要代謝途徑為氧化代謝[5]，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性、治療心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等藥理作用[6]。

圖1 歐前胡素分子結(jié)構(gòu)

20世紀(jì)80年代末以來(lái)，已發(fā)現(xiàn)大量自然來(lái)源的TY抑制劑，但大部分抑制劑由于安全性及穩(wěn)定性問(wèn)題，而限制了其應(yīng)用[7]，尋找天然、高效、安全的TY抑制劑在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)等多個(gè)學(xué)科和領(lǐng)域都具有重大意義。目前對(duì)歐前胡素藥理作用的研究大部分只停留在藥效層面或僅關(guān)注其對(duì)一個(gè)或某幾個(gè)信號(hào)通路的影響，在作用機(jī)制方面的研究尚不夠深入[6]。隨著對(duì)歐前胡素提取分離方法以及作用機(jī)制研究的深入，對(duì)于以歐前胡素為主要成分中藥的藥效的闡明以及新藥的研發(fā)將具有重要的意義[8]。胡大強(qiáng)等人[9]報(bào)道白芷提取物中主要含有歐前胡素，其對(duì)TY有抑制作用，而且其對(duì)TY的抑制活性較熊果苷更強(qiáng)。吳迪等[10]證明歐前胡素可以直接導(dǎo)致黑素瘤細(xì)胞凋亡、抑制TY活性或阻斷黑素合成，從而治療或預(yù)防黃褐斑。本文通過(guò)多種光譜學(xué)方法(紫外、熒光及圓二色光譜)并結(jié)合分子模擬技術(shù),研究了歐前胡素體外抑制TY活性的分子機(jī)制，以期為歐前胡素作為食品功能因子研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；F-7000型熒光光度計(jì)(日本，日立公司)；MOS-450型圓二光譜儀(法國(guó)，Bio-Logic公司)；Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國(guó)，密理博司)；pHS-3C型PH酸度計(jì)(上海，雷磁)。

歐前胡素(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，純度99.8%)；TY(Worthington Biochemical Corporation)；左旋多巴(南京奧多福尼生物科技有限公司；純度>98.0%)；歐前胡素用無(wú)水乙醇配成濃度為6.67×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備液，TY、左旋多巴(L-dopa)和曲酸用磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.8，0.05 mol·L-1)分別配制成濃度為1.25×10-5mol·L-1，5.0×10-3mol·L-1(現(xiàn)配現(xiàn)用)和2.73×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備液。其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 歐前胡素對(duì)酪氨酸酶的抑制活性測(cè)定

在總體積為2 mL，磷酸鹽(pH 6.8，0.05 mol·L-1)溶液為緩沖液的體系中，固定TY的濃度為1.25×10-7mol·L-1，加入一系列不同濃度梯度的歐前胡素，在30 ℃的條件下孵化1 h。孵化完成后，加入底物L(fēng)-dopa(5.0×10-3mol·L-1)，用紫外-可見分光光度計(jì)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)模塊測(cè)定反應(yīng)體系在200s內(nèi)475 nm處的吸光度值，再通過(guò)公式(1)計(jì)算出不同濃度歐前胡素存在下TY的相對(duì)活性，并計(jì)算歐前胡素的半抑制濃度(IC50)。曲酸作為陽(yáng)性對(duì)照。R0、R分別表示無(wú)抑制劑和含有不同濃度抑制劑反應(yīng)體系的吸光度變化率。

相對(duì)酶活性(%)=(R/R0)×100%

(1)

1.2.2 歐前胡素對(duì)酪氨酸酶的抑制可逆性測(cè)定

固定底物L(fēng)-dopa的濃度為5.0×10-4mol·L-1，進(jìn)行4組實(shí)驗(yàn)，測(cè)定在不同濃度歐前胡素的體系中，酶促反應(yīng)速率(ΔOD)隨TY濃度增大的變化趨勢(shì)，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作出ΔOD與TY濃度的關(guān)系圖，從而分析歐前胡素對(duì)TY的抑制作用是否可逆。若四條直線均交于原點(diǎn)，則說(shuō)明抑制作用可逆；若四條直線互相平行，說(shuō)明抑制作用不可逆。

1.2.3 判斷歐前胡素對(duì)酪氨酸酶的抑制類型

在與1.2.2相同的實(shí)驗(yàn)條件下，另設(shè)4組實(shí)驗(yàn)，固定TY的濃度為1.25×10-7mol·L-1，分別加入不同濃度的歐前胡素，測(cè)定反應(yīng)體系中ΔOD隨底物L(fēng)-dopa濃度增加的變化趨勢(shì)，再根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，分析歐前胡素對(duì)TY的抑制類型。

1.2.4 熒光光譜的測(cè)定

(1) 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)

將熒光光譜的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描范圍300～450 nm。在1 cm的熒光池中，加入3.0×10-6mol·L-1的TY溶液3 mL，測(cè)定其熒光光譜后，再逐次加入3.0×10-4mol·L-1的歐前胡素，每次20 μL，混合均勻后靜置2 min，分別掃描25 ℃，31 ℃和37 ℃ 3個(gè)溫度下反應(yīng)體系的熒光光譜。為了扣除“內(nèi)濾光效應(yīng)”的影響，本實(shí)驗(yàn)的熒光數(shù)據(jù)均要經(jīng)過(guò)公式(2)進(jìn)行校正[11]。Fm和Fc分別是校正前后的熒光強(qiáng)度；A1、A2分別表示歐前胡素在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)處的紫外吸收值。

FC=Fme(A1+A2)/2

(2)

(2) 同步熒光光譜的測(cè)定

在25 ℃的條件下，設(shè)置實(shí)驗(yàn)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的差值(Δλ=λem-λex)分別為15和60 nm，與熒光猝滅實(shí)驗(yàn)一樣，逐次加入20 μL的歐前胡素，測(cè)定反應(yīng)體系在230～350 nm的同步熒光光譜，分析歐前胡素對(duì)TY中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基微環(huán)境的影響。

(3) 三光維熒光譜的測(cè)定

設(shè)置三維熒光光譜的實(shí)驗(yàn)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描范圍200～600 nm。固定反應(yīng)體系的總體積為2 mL，TY的濃度為2.0×10-5mol·L-1，歐前胡素的濃度為3.0×10-3mol·L-1，再分別掃描TY和歐前胡素-TY復(fù)合物的三維熒光光譜。

1.2.5 圓二色(CD)光譜實(shí)驗(yàn)

設(shè)置實(shí)驗(yàn)掃描范圍為190～250 nm，掃描速度為60 nm min-1，并固定體系中TY的濃度為2.0×10-6mol·L-1，掃描歐前胡素與TY摩爾比分別為0:1、4:1和8:1時(shí)體系的CD光譜，再根據(jù)在線程序軟件計(jì)算得出TY二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲)的含量，從而分析歐前胡素對(duì)TY二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[12]。

1.2.6 分子模擬

運(yùn)用Discovery Studio 4.5軟件中的LibDock對(duì)接程序進(jìn)行歐前胡素與TY的分子對(duì)接模擬。TY的晶體結(jié)構(gòu)從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB，http://www.rcsb.org/，ID：2Y9X)獲得。根據(jù)TY特殊的四聚體結(jié)構(gòu)，選擇A鏈進(jìn)行對(duì)接仿真優(yōu)化，然后進(jìn)行氫化和極性加成操作。歐前胡素的結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索。歐前胡素系統(tǒng)的分子對(duì)接采用CDOCKER程序，運(yùn)行次數(shù)為100次，選取最優(yōu)的歐前胡素-TY配合物的結(jié)合姿態(tài)進(jìn)行對(duì)接分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 歐前胡素對(duì)酪氨酸酶的抑制活性的測(cè)定

由圖2可知，隨著歐前胡素濃度的增加，TY的相對(duì)活性逐漸下降，當(dāng)歐前胡素的濃度達(dá)到1.5×10-4mol·L-1，TY的相對(duì)活性降為31.16%，表明歐前胡素明顯抑制了TY的活性，且屬于濃度依賴型。同時(shí)，由圖可求出歐前胡素的IC50為7.90×10-5mol·L-1，陽(yáng)性對(duì)照(曲酸)的IC50為4.03×10-5mol·L-1，說(shuō)明歐前胡素對(duì)TY活性有較好的抑制效果。

[I]/(10-5 mol·L-1)

2.2 歐前胡素對(duì)酪氨酸酶的抑制可逆性分析

由圖3可知，隨著歐前胡素濃度的增加，ΔOD與TY濃度關(guān)系擬合直線的斜率不斷減小，且四條擬合直線均交于原點(diǎn)，說(shuō)明歐前胡素能使TY催化速率下降，但不能使TY失活，由此判斷出歐前胡素對(duì)TY的抑制作用是可逆的。

[Tyrosinase]/(10-8 mol·L-1)

2.3 歐前胡素對(duì)酪氨酸酶的抑制類型分析

由圖4可知，通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，可以得到一組線性關(guān)系良好的擬合直線，該組直線交于第二象限，且隨著歐前胡素濃度不斷增大，Km值不斷增大，Vmax值不斷減小，由此推測(cè)出歐前胡素對(duì)TY的抑制類型為混合型抑制[13]，其雙倒數(shù)方程[14]如下：

(3)

(4)

(5)

式中，ν為酶促反應(yīng)速率，Km為米氏常數(shù)，Vmax為最大酶促反應(yīng)速率，[I]表示歐前胡素的濃度，[S]表示底物L(fēng)-dopa的濃度，Ki為抑制常數(shù)，α為表觀系數(shù)。

用直線斜率和截距分別對(duì)歐前胡素濃度作圖，線性關(guān)系良好(R2(Y-intercept)=0.987 9，R2(slope)=0.997 3)，表明歐前胡素與TY有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，再通過(guò)計(jì)算得出歐前胡素對(duì)TY的Ki為7.54×10-5mol·L-1，α為2.88，α>1，說(shuō)明歐前胡素與游離TY的結(jié)合親和力較強(qiáng)[15]。

c(TY)=1.25×10-7 mol·L-1，c(Imperatorin)=0，3.75，7.5 and 11.25×10-5 mol·L-1for curve a→d，respectively.

2.4 歐前胡素對(duì)酪氨酸酶熒光光譜的影響分析

2.4.1 猝滅機(jī)制、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及熱力學(xué)分析

如圖5(A)所示，隨著歐前胡素濃度的增大，TY的熒光強(qiáng)度不斷下降，說(shuō)明歐前胡素猝滅了TY的內(nèi)源熒光，此外，歐前胡素的加入還引起了TY的熒光峰位紅移，表明歐前胡素與TY發(fā)生了相互作用。再根據(jù)Stern-Volmer方程[16]進(jìn)一步分析歐前胡素對(duì)TY的熒光猝滅機(jī)制；

(6)

式中，F(xiàn)0和F分別為歐前胡素加入前后TY的熒光強(qiáng)度；[Q]為歐前胡素的濃度；Ksv為猝滅常數(shù)；Kq為猝滅過(guò)程中的速率常數(shù)；τ0代表無(wú)猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命，其值約為10-8s[17]。

λ/nm

[Imperatorin]/(10-6 moL·L-1)

通過(guò)F0/F對(duì)[Q]作圖，得出3個(gè)溫度(25 ℃，31 ℃和37 ℃)下的猝滅常數(shù)Ksv(表1)，雖然隨著溫度升高，Ksv值增大，但是Kq遠(yuǎn)大于2×1010L·mol-1·s-1(最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù))，表明歐前胡素對(duì)TY的熒光猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)型。

(7)

[Qt]為歐前胡素的濃度，[Pt]為TY的濃度。由表1可知，Ka在104數(shù)量級(jí)，說(shuō)明歐前胡素對(duì)TY有中等強(qiáng)度的結(jié)合親和力。在25 ℃，31 ℃，37 ℃ 3個(gè)溫度下，n值均約等于1，說(shuō)明TY中僅有一個(gè)供歐前胡素結(jié)合的位點(diǎn)。熱力學(xué)參數(shù)可以通過(guò)van’t Hoff方程求出：

(8)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(9)

R是氣體常數(shù)(8.314 J·mol-1·K-1)，Ka為結(jié)合常數(shù)。從表1中可以看出，ΔG°<0，說(shuō)明歐前胡素與TY的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的，ΔH°>0，ΔS°>0，說(shuō)明疏水作用力在歐前胡素與TY結(jié)合的過(guò)程發(fā)揮了主要作用[19]。

表1 不同溫度下歐前胡素與TY作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與熱力學(xué)參數(shù)值

2.4.2 歐前胡素對(duì)酪氨酸酶的同步熒光光譜的影響分析

圖6分別表示Δλ為15和60 nm時(shí)歐前胡素與TY反應(yīng)的同步熒光光譜。隨著加入的歐前胡素濃度的不斷增大，Tyr殘基(圖6A)和Trp殘基(圖6B)的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度不斷降低，峰位無(wú)明顯的移動(dòng)，說(shuō)明歐前胡素的加入對(duì)Tyr和Trp殘基周圍微環(huán)境幾乎不造成影響[20]。由同步熒光猝滅比率(RSFQ=1-F/F0)與歐前胡素濃度關(guān)系圖(圖6C)可知，Δλ=15 nm時(shí)歐前胡素的RSFQ值始終大于其在Δλ=60 nm時(shí)的值，說(shuō)明Tyr對(duì)TY的熒光猝滅貢獻(xiàn)更大，并且Tyr殘基更靠近結(jié)合位點(diǎn)。

λ/nm λ/nm[Imperatorin]/(10-6 moL·L-1)

2.4.3 三維熒光光譜分析

圖7(A)是TY的三維熒光光譜，Peak a和Peak b分別表示瑞利散射峰(λex=λem)和二階散射峰(λex=2λem)，Peak 1(λex/λem=280 nm/340 nm)表示Tyr和Trp殘基的熒光特征峰，Peak 2(λex/λem=230 nm/335 nm)是TY多肽主鏈結(jié)構(gòu)n→π*躍遷引起的。與熒光光譜圖(A)相比，添加歐前胡素后，熒光光譜圖(B)中Peak a熒光強(qiáng)度明顯增加，Peak b熒光強(qiáng)度稍有減弱，表明歐前胡素與TY結(jié)合形成歐前胡素-TY復(fù)合物，從而增強(qiáng)了瑞利散射。Peak 1的熒光強(qiáng)度下降了12.09%，峰位未改變，表明Tyr和Trp殘基的微環(huán)境幾乎沒(méi)有受到歐前胡素的干擾，這與同步熒光的結(jié)果一致。Peak 2的熒光強(qiáng)度下降了21.82%，表明歐前胡素-TY復(fù)合物的形成改變了TY的多肽主鏈結(jié)構(gòu)，詳細(xì)數(shù)據(jù)列于表2中。

圖7 游離TY(A)和TY-歐前胡素體系(B)的三維熒光光譜

表2 游離TY和TY-歐前胡素體系的三維熒光光譜值

2.5 歐前胡素對(duì)TY的CD光譜的影響分析

圖8為不同濃度的歐前胡素與TY作用的CD光譜，由圖可知，TY在210～230 nm內(nèi)可以依稀辨認(rèn)出兩個(gè)負(fù)峰，但是歐前胡素在此范圍內(nèi)無(wú)明顯的特征光譜峰，且隨著歐前胡素濃度增大，CD特征光譜有一定的變化。通過(guò)在線軟件計(jì)算出TY的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果列于表3中，與游離的TY二級(jí)結(jié)構(gòu)相比，加入歐前胡素后([歐前胡素:TY]=4:1和8:1)，TY的α-螺旋含量有明顯的降低，從43.6%降至34.7%，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量有一定程度上升，表明歐前胡素使TY的結(jié)構(gòu)變得松散且更不穩(wěn)定。

λ/nm圖8 歐前胡素對(duì)TY的CD光譜的影響

表3 TY和TY-歐前胡素體系的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

2.6 分子模擬分析

圖9(A)展示了歐前胡素與TY對(duì)接后的最佳結(jié)合位置，歐前胡素插入了TY的活性中心，并與周圍的氨基酸殘基發(fā)生了相互作用。由圖(B)可知，歐前胡素通過(guò)疏水作用力與氨基酸殘基His244、Val283、Val286、His263相互作用，并通過(guò)范德華力與Val248、Phe264、Gly281等氨基酸殘基相互作用，表明歐前胡素與TY的結(jié)合除了受疏水相互作用

圖9 (A)歐前胡素與TY最佳結(jié)合姿態(tài)的空間結(jié)構(gòu)圖(B)TY中與歐前胡素相互作用的氨基酸殘基的2D結(jié)構(gòu)圖

驅(qū)動(dòng)外，還存在一定程度的范德華力，這與熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。通過(guò)分子模擬結(jié)果推測(cè)歐前胡素對(duì)TY的抑制作用可能是因?yàn)闅W前胡素占據(jù)了TY的活性位點(diǎn)，阻止了底物與活性中心結(jié)合，從而導(dǎo)致TY催化活性下降。

3 結(jié)論

歐前胡素對(duì)TY有良好的抑制作用，是一種可逆的混合型TY抑制劑，且更傾向于與游離的TY結(jié)合。歐前胡素對(duì)TY是靜態(tài)型猝滅，兩者有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的，主要驅(qū)動(dòng)力為疏水作用力。歐前胡素的加入對(duì)Tyr和Trp殘基周圍的微環(huán)境基本上不造成影響，但使TY的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得松散，主要表現(xiàn)在α-螺旋含量明顯下降，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲含量有一定程度上升。分子模擬結(jié)果顯示歐前胡素插入到TY的活性中心，通過(guò)疏水力與氨基酸殘基His244、Val283、Val286、His263相互作用。因此推測(cè)歐前胡素對(duì)TY的抑制作用可能是因?yàn)闅W前胡素占據(jù)了TY的活性中心位點(diǎn)，阻止底物與活性中心結(jié)合，從而抑制了TY催化活性。