楊彩玲，趙雪珺，李建穎，趙國虎，2，張麗，曹文濤

1(蘭州城市學院 化學化工學院，甘肅 蘭州，730070) 2(“城市環(huán)境污染控制”甘肅省高校省級重點實驗室，甘肅 蘭州，730070)3(西北師范大學 化學化工學院，甘肅 蘭州，730070)

四環(huán)素(tetracycline，TET)是一種價格低廉且最為常用的廣譜性抗生素，能有效抑制革蘭氏陽性和陰性細菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體和寄生蟲等感染[1]，作為飼料添加劑和治療藥物被大量用于預(yù)防和治療奶牛乳房炎等嚴重疾病，但使用不當或濫用會導(dǎo)致牛奶中過量殘留，對消費者健康造成危害，如引起過敏反應(yīng)或抗藥性、損害肝臟、使腸胃功能紊亂等[2-3]。國際衛(wèi)生組織、歐盟和我國規(guī)定四環(huán)素在牛奶中的最大殘留限量為100 μg/L[4-5]。但即使牛奶中殘留水平很低，長期飲用也會在人體內(nèi)蓄積，增大健康風險。我國乳業(yè)自“三聚氰胺”事件之后，乳品質(zhì)量有了很大提高，但迄今為止，鮮牛奶中抗生素殘留超標現(xiàn)象還時有發(fā)生，特別是一些個體散賣的鮮牛奶[6-9]，因此，監(jiān)測四環(huán)素在鮮牛奶中的殘留情況十分必要?，F(xiàn)有的四環(huán)素殘留檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、毛細管電泳法等[10]。酶聯(lián)免疫法抗體制備時間長，穩(wěn)定性差；色譜法靈敏度高，可以多組分同時測定，但儀器昂貴、操作復(fù)雜耗時，還需要專業(yè)的操作人員，限制了它們在現(xiàn)場和實時檢測中的應(yīng)用。因此，建立一種簡便、快速、靈敏的四環(huán)素測定方法，對牛奶質(zhì)量控制具有重要意義。

近年來，基于量子點的熒光傳感分析方法因靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)時間短、操作簡便及成本低等諸多優(yōu)點而備受關(guān)注，已廣泛應(yīng)用于藥物殘留[11-14]、生物毒素[15]、違禁添加[16]等食品安全檢測。在抗生素檢測方面，毛永強[13]、YANG等[17]分別通過制備CdTe量子點和碳量子點對牛奶中的土霉素和魚肉中的四環(huán)素進行了靈敏測定。相比于金屬半導(dǎo)體量子點和碳量子點，硅量子點(silicon quantum dots, SiQDs)不僅水溶性好，光穩(wěn)定性強，無毒，并且擁有高的熒光量子產(chǎn)率和豐富的硅源，在分析檢測、生物成像、藥物傳遞等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[18-21]。本文以水熱法合成硅量子點，利用四環(huán)素能有效猝滅硅量子點熒光，首次提出了基于硅量子點熒光傳感的四環(huán)素檢測新方法，應(yīng)用于鮮牛奶中四環(huán)素殘留的測定，并對傳感機理進行了研究，旨在為四環(huán)素殘留的快速檢測提供一種新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TECNAIG2型場發(fā)射透射電子顯微鏡，美國FEI公司；FLS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀，英國EI公司；NEXUS 670型紅外光譜儀，美國 Thermo Nicolet公司；RF-5301型熒光分光光度計，日本島津公司；Tu-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

無水檸檬酸、KCl、MgCl2、CaCl2、NaCl、硝酸鋅、FeCl3，廣州化學試劑廠；半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，上海阿拉丁試劑公司；磷酸、醋酸、硼酸、維生素C，國藥集團化學試劑公司；四環(huán)素、土霉素、紅霉素，上海恒遠生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖，重慶茂業(yè)化學試劑有限公司；乳糖、EDTA，成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 SiQDs的制備

SiQDs的制備參照文獻[22]并修改如下：在50 mL錐形瓶中加入5 mL 超純水，然后在攪拌下依次加入50 mg無水檸檬酸和1.0 mL AEAPMS，充分攪拌后將上述混合溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中，240 ℃反應(yīng)2 h，自然冷卻至室溫。準確移取250 μL SiQDs 溶液加水稀釋并定容至50 mL，儲存在4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 熒光測定

在10 mL比色管中，依次加入一定體積不同濃度四環(huán)素標準溶液和30 μL上述稀釋后的SiQDs溶液，用pH 7.0的B-R緩沖溶液稀釋定容至5.0 mL，搖勻，靜置1 min后在室溫及激發(fā)光波長為370 nm條件下測定體系熒光光譜(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm)。根據(jù)lg(F0/F)與C(四環(huán)素濃度)繪制工作曲線(F0和F分別代表未加入和加入 TET 時的熒光強度)。

1.2.3 牛奶樣品的處理和測定

生鮮牛奶購自當?shù)?個不同散養(yǎng)售賣點。每個點相隔1 d購買1份，各買3份，共收集樣品21份，所有樣品均于購買當天處理后冰箱冷藏保存。樣品處理過程為：準確移取鮮奶5.0 mL，加入含有20 mmol/L EDTA的McIlvaine buffer 緩沖溶液(pH 5.0)3 mL，質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸2 mL，渦旋振蕩5 min，之后在4 ℃ 10 000 r/min下離心10 min以脫去蛋白質(zhì)，再向上清液中加入2 mL氯仿渦旋振蕩5 min以除去脂肪并再次離心。取上清液用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后準確移取4.5 mL,按1.2.2的方法制備待測樣品溶液進行熒光測定，平行測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 量子點的形貌結(jié)構(gòu)、光學性質(zhì)及穩(wěn)定性

a-SiQDs的TEM圖片;b-SiQDs的紅外光譜圖圖1 SiQDs 的表征Fig.1 Characterization of SiQDs

通過FLS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測量[23]并計算該量子點的絕對熒光量子產(chǎn)率為18.93%。根據(jù)圖2-a SiQDs在不同激發(fā)波長下掃描的發(fā)射光譜圖，該量子點發(fā)射峰位置與激發(fā)光無關(guān)，說明所制備的SiQDs的發(fā)射光不具有激發(fā)光依賴特性，但發(fā)射光強度隨激發(fā)波長的增加先增大后減小，在370 nm達到最大。SiQDs的紫外吸收光譜和熒光激發(fā)、發(fā)射光譜如圖2-b所示，230 nm 處出現(xiàn)的吸收峰可能是羰基發(fā)生π-π*電子躍遷引起，同時SiQDs 表面的官能團發(fā)生n-π*躍遷造成了352 nm處出峰。SiQDs 最佳激發(fā)波長為370 nm，最佳發(fā)射波長為465 nm；內(nèi)插圖顯示，SiQDs在自然光下接近無色，365 nm紫外光照射下發(fā)出明亮的藍光。

a-不同激發(fā)波長下的熒光光譜圖;b- UV-vis、熒光激發(fā)和發(fā)射光譜、自然光和365 nm下照片圖2 SiQDs的光譜圖Fig.2 The spectrum of SiQDs

測定不同酸度(pH 3～12)B-R緩沖溶液中SiQDs 的熒光強度發(fā)現(xiàn)，當pH 3時，SiQDs 的熒光強度相對較低，pH 在4～9之間時，SiQDs 的熒光強度較高且穩(wěn)定；而當 pH>9 時，其熒光強度又逐漸增大。這主要是由于SiQDs 表面官能團的質(zhì)子化-去質(zhì)子化作用引起的。此外，向溶液中加入一定濃度NaCl，觀察到SiQDs在鹽濃度為0～100 mmol/L的范圍內(nèi)熒光強度沒有明顯改變。比較在370 nm 激發(fā)光連續(xù)照射0～30 min以及保持溶液溫度分別為20、25、35、45 ℃的條件下SiQDs的熒光強度，發(fā)現(xiàn)SiQDs的熒光強度基本不變，以上說明所制備的SiQDs具有良好的穩(wěn)定性和強的抗光漂白能力。

2.2 溶液酸度和反應(yīng)時間的選擇

溶液酸度會影響量子點的發(fā)光性質(zhì)，通常也會影響量子點與目標分析物之間的相互作用。圖3-a是在pH 3～12的測定體系中加入四環(huán)素后熒光猝滅效率(F0/F)隨pH變化的情況?？梢钥闯觯谒鶞y試的pH范圍內(nèi)，pH=7時猝滅最好。因此，實驗選擇在pH 7的B-R緩沖液中進行測定。圖3-b是在pH為7的熒光測定體系中加入四環(huán)素分別反應(yīng)0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30 min后測定的熒光強度，由圖可見，猝滅在1min內(nèi)即可達到平衡，說明利用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對四環(huán)素的快速檢測。

a-溶液酸度對體系熒光猝滅的影響;b-反應(yīng)時間對體系熒光猝滅的影響圖3 實驗條件的選擇(cTET=6 μmol/L)Fig.3 Selection of experimental conditions

2.3 量子點對四環(huán)素的選擇性

2.4 樣品分析

2.4.1 工作曲線

按照1.2.2實驗方法，測定加入不同濃度四環(huán)素標準溶液后體系的熒光光譜，結(jié)果顯示：隨著四環(huán)素濃度的增加，體系熒光強度逐漸降低。四環(huán)素在0.05～90 μmol/L的濃度范圍內(nèi)與體系相對熒光強度的對數(shù)lg(F0/F)呈良好線性關(guān)系，線性方程為lg(F0/F)=0.0118 4c+0.015 78，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4, 檢出限為18 nmol/L (3σ/k)，低于鮮乳中規(guī)定的四環(huán)素限量標準。對含有6.0 μmol/L四環(huán)素的熒光體系平行測定8次，相對標準偏差為2.7%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性，能滿足實際樣品中四環(huán)素分析要求。

2.4.2 樣品測定結(jié)果及回收率

在選定的實驗條件下，根據(jù)實驗方法測定生鮮牛奶中四環(huán)素的殘留量。結(jié)果表明，21份生鮮奶中均未檢出四環(huán)素，一定程度上說明該地區(qū)目前生鮮牛奶中四環(huán)素殘留風險較小。任取其中一份樣品進行加標回收率試驗，加標水平為75、100、200 μg/L，處理方法與樣品相同，每個濃度水平重復(fù)測定6次，測得3個濃度水平的加標回收率為92.36%～104.07 %，相對標準偏差(RSD)為2.1%～4.2%(表1)，表明所建立的方法準確可靠，可用于實際乳樣分析。

表1 四環(huán)素在生鮮奶中的回收率(n=6)Table 1 Recoveries of TET in fresh milksamples(n=6)

注：ND代表低于檢測限

2.5 猝滅機理

從圖4可以看出，SiQDs 的激發(fā)光譜在300～450 nm的波長范圍內(nèi)(曲線a)，四環(huán)素在此范圍內(nèi)有吸收，吸收峰位于355 nm(曲線b)，二者間有相當程度的光譜重疊，滿足發(fā)生熒光內(nèi)濾的條件，可以推斷猝滅機理主要是內(nèi)濾效應(yīng)。因此，當體系中加入四環(huán)素后，作為熒光體的SiQDs的激發(fā)光能量被熒光受體四環(huán)素有效吸收，導(dǎo)致體系熒光強度降低。

圖4 SiQDs 的熒光光譜(曲線a)和四環(huán)素的UV-vis吸收光譜圖(曲線b)Fig.4 Fluorescence spectra of SiQDs (curve a)andUV-Vis absorption spectra of TET(curve b)

由圖5可知，四環(huán)素在274 nm 和355 nm各有一個吸收峰，當與SiQDs 相互作用后，274 nm的峰消失，355 nm的峰以及SiQDs 352 nm 的吸收峰發(fā)生紅移，說明四環(huán)素分子與SiQDs中的羧基或氨基通過氫鍵作用形成了基態(tài)復(fù)合物，猝滅過程應(yīng)為靜態(tài)猝滅。因為動態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，而不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜[24]。

圖5 SiQDs、TET以及混合溶液的UV-vis吸收光譜Fig.5 UV-vis absorption spectra of the SiQDs，TET andthe mixture of the SiQDs and TET

進一步通過測量加入四環(huán)素前后SiQDs 的熒光壽命進行確定，發(fā)現(xiàn)加入四環(huán)素后SiQDs 的熒光壽命幾乎沒有改變(圖6)，說明猝滅為靜態(tài)猝滅[25]。因此，可以認為四環(huán)素對 SiQDs 的熒光猝滅主要為內(nèi)過濾效應(yīng)和靜態(tài)猝滅協(xié)同作用的結(jié)果。

圖6 加入TET前后SiQDs 的時間分辨衰減曲線Fig.6 Time-resolved decay curves of SiQDs in theabsence and presence of TET

3 結(jié)論

本文通過水熱法一步合成了水溶性的熒光硅量子點，合成方法簡單，避免了耗時的表面修飾過程，所合成的 SiQDs 具有良好的熱穩(wěn)定性、優(yōu)異的耐鹽性和抗光漂白能力。利用四環(huán)素與SiQDs之間存在內(nèi)過濾效應(yīng)和靜態(tài)猝滅的協(xié)同作用構(gòu)建了新型熒光傳感器用于鮮奶中四環(huán)素測定，方法快速、靈敏、準確，并且不需要昂貴的設(shè)備，為鮮奶中四環(huán)素殘留檢測提供了一種新思路。