張 強,宋 寶,謝冬梅, 2,王國凱
(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護與開發(fā)研究所,安徽 合肥 230012)
白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.或杭白芷A.dahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f. var. formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根[1],具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛、消腫排膿、生肌起痿、燥濕止帶之功效[2-3]。香豆素類成分是白芷中主要成分[4-5]。
一測多評法是利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,只測定一個成分從而實現(xiàn)多個成分的同步測定,是一種較為簡單易行的中藥多指標評價的新方法與多指標質(zhì)量評價的新模式[6]。楊芳等[7]建立一測多評法測定川白芷藥材中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的含量,可準確控制川白芷的質(zhì)量。
商品白芷經(jīng)過硫磺熏蒸,其有效成分含量會明顯降低[8]。如何建立一種簡便、易行、快捷的方法比較無硫和低硫白芷的質(zhì)量差異,是目前整體評價無硫和低硫白芷質(zhì)量的難題。本研究建立了一測多評方法比較無硫和低硫白芷中歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯及水合氧化前胡素等5種香豆素類成分的含量,以期為評價白芷藥材質(zhì)量提供依據(jù)。
1.1 試藥 甲醇(色譜純):德國Merck公司;水為超純水;水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素對照品(批號分別為CFS201801、CFS201801、CFS201802、CFS201802,純度均為98%):武漢天植生物技術(shù)有限公司;異歐前胡素(批號110827-201812):中國食品藥品檢定研究院。白芷藥材2017年收集于安徽亳州、四川遂寧、河南禹州等地(見表1),由安徽中醫(yī)藥大學(xué)生藥系謝冬梅副教授鑒定為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.的干燥根。
表1 白芷樣品表
1.2 儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1100、Shimadzu LC-16型及Thermo U3000型);色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);AX324ZH型電子天平:奧豪斯儀器有限公司;AB135-S電子天平:瑞士梅特勒托利多公司;JK-450B型超聲儀:合肥金克尼機械制造有限公司。
2.1 溶液的制備
2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素對照品,加甲醇溶解,定容,制得水合氧化前胡素0.495 mg/mL、佛手柑內(nèi)酯0.195 mg/mL、氧化前胡素0.995 mg/mL、歐前胡素2.000 mg/mL及異歐前胡素0.995 mg/mL混合對照品溶液。過0.22 μm微孔濾膜,待用。
2.1.2 供試品溶液的制備 取白芷藥材粉末(過3號篩)約0.5 g,精密稱定,置50 mL離心管中,加甲醇25 mL,稱質(zhì)量,超聲(功率為300 W,頻率為50 kHz)提取1 h后,冷卻至室溫,甲醇補足質(zhì)量,離心(溫度為4 ℃,轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,離心時間為5 min),靜置,吸取上清液,過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。
2.1.3 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),水(A)-甲醇 (B)流動相,梯度洗脫(見表2);流速為1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長300 nm,進樣量10 μL。見圖1。
表2 梯度洗脫程序
圖1對照品(A)與白芷樣品(B)的高效液相色譜圖(1.水合氧化前胡素;2.佛手柑內(nèi)酯;3.氧化前胡素;4.歐前胡素;5.異歐前胡素)
2.1.4 線性關(guān)系考察 將“2.1.1”項下對照品溶液分別精密吸取0.2、0.4、0.8、2.0、4.0 mL,置10 mL容量瓶中,加甲醇定容,按“2.1.3”項下的色譜條件測定,記錄。以白芷的5個對照品溶液濃度(ρ)為橫坐標,以對應(yīng)對照品的峰面積(A)為縱坐標,建立標準曲線。見表3。
表3 香豆素成分的線性關(guān)系
2.1.5 精密度試驗 取混合對照品溶液,重復(fù)進樣6次,測定,記錄峰面積, RSD值分別為0.26%,0.47%,0.12%,0.07%,0.16%。表明儀器精密度良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗 選取1號樣品,按“2.1.2”項方法制得供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h測定,記錄峰面積。結(jié)果RSD值分別為2.04%、1.67%、1.73%、1.73%、1.56%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.7 重復(fù)性試驗 選取1號樣品,平行6份,精密稱定,按“2.1.2”方法制備供試品溶液,測定并記錄峰面積計算其含量,結(jié)果RSD值分別為1.25%、0.89%、1.32%、0.96%、1.12%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取14號樣品6份,分別加入一定量對照品溶液,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。測定并記錄峰面積,計算回收率,見表4。結(jié)果表明水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素平均回收率分別為96.74%、99.69%、100.26%、99.48%、101.74%,RSD值分別為0.82%、0.97%、0.77%、0.65%、0.33%。說明該方法的加樣回收率良好。
2.2 相對校正因子的確定
2.2.1 相對校正因子的計算 根據(jù)在色譜定量分析的基本理論,高效液相響應(yīng)值的大小與各物質(zhì)的質(zhì)量呈線性關(guān)系,即m=f·A。相對校正因子fi/s=fi/fs=(Ai×ms)/(mi×As),其中As為內(nèi)標物峰面積,ms為內(nèi)標物的質(zhì)量,Ai為待測成分i的峰面積,mi為待測成分i的質(zhì)量。取“2.1.1”項下對照品溶液。按“2.1.3”項下色譜條件,改變進樣量為2、4、8、10、20 μL,記錄峰面積,計算各校正因子。見表5。
表4 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)
表5 以歐前胡素為內(nèi)標、其余4個香豆素類
注:f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素);f2為f(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯);f3為f(歐前胡素/氧化前胡素);f4為f(歐前胡素/異歐前胡素);各校正因子均為平行測定3次結(jié)果的均值
2.2.2 儀器和色譜柱的考察 取“2.1.1”項下對照品溶液,在“2.1.3”項下的色譜條件,平行進樣3次,得各峰面積平均值,計算各相對校正因子,由表6可知RSD均小于3.0%,結(jié)果表明不同高效液相色譜儀及色譜柱對相對校正因子無顯著影響。見表6。
2.2.3 不同柱溫、流速對校正因子的影響 同一色譜條件下,考察25、30、35 ℃柱溫、考察0.9、1.0、1.1 mL/min流速對校正因子的影響。由表7可知,柱溫及流速的變化對相對校正因子無顯著影響。
表6 不同儀器和不同色譜柱測定的相對校正因子值(n=3)
注:f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素),f2為f(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯),f3為f(歐前胡素/氧化前胡素),f4為f(歐前胡素/異歐前胡素)
2.2.4 待測成分色譜峰的定位 在確定各待測成分的位置時,選取保留時間差值和相對保留時間值兩種方法定位。為了增加定位各組分的可信度,采用了不同的高效液相色譜儀和不同色譜柱進行定位考察。由表8可知t(歐前胡素/水合氧化前胡素)、t(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯)、t(歐前胡素/氧化前胡素)、t(歐前胡素/異歐前胡素)、Δt(歐前胡素/水合氧化前胡素)、Δt(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯)、Δt(歐前胡素/氧化前胡素)、Δt(歐前胡素/異歐前胡素)的RSD分別為1.94%、2.15%、0.86%、1.76%、19.43%、32.49%、50.88%、39.27%。結(jié)果表明相對保留時間的重復(fù)性較好。
2.3 一測多評法與外標法的比較 精密稱取20批藥材粉末0.5 g,按“2.1.2”項方法制成供試品溶液,進樣,記錄峰面積,采用外標法和一測多評法分別計算各成分的含量。由表9可知兩種方法所測得5種香豆素成分含量結(jié)果基本一致,表明一測多評法在無硫和低硫白芷多成分測定是可行的。
表7 不同流速對白芷4種校正因子的影響(n=3)
注:f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素),f2為f(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯),f3為f(歐前胡素/氧化前胡素),f4為f(歐前胡素/異歐前胡素)
表8 相對保留值及保留時間差值的比較(n=3)
注:t1為t(歐前胡素/水合氧化前胡素),t2為t(歐前胡素/佛手柑內(nèi)酯),t3為t(歐前胡素/氧化前胡素),t4為t(歐前胡素/異歐前胡素);相對保留時間為歐前胡素與水合氧化前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素的保留時間之比,保留時間差的絕對值為各物質(zhì)與歐前胡素保留時間差值的絕對值
表9 外標法和一測多評法測定無硫和低硫白芷中5種成分的含量
前期研究基礎(chǔ)結(jié)合相關(guān)文獻[9-11],確定色譜條件為甲醇-水系統(tǒng),柱溫為30 ℃,進樣量為10 μL,波長為300 nm,流速為1.0 mL/min。該方法分離度良好,可以對白芷多成分進行定量分析。
本研究通過一測多評對水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素5種白芷中香豆素類成分含量進行了測定。通過不同儀器、色譜柱、進樣量、流速及柱溫可知相對校正因子的RSD值均小于3.0%,說明各因素對相對校正因子無顯著性影響,確立的4種校正因子適用于白芷的一測多評法含量測定。與無硫相比,低硫白芷各成分含量均有下降,且佛手柑內(nèi)酯與氧化前胡素最為明顯。僅有部分低硫白芷歐前胡素含量符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定,說明僅以歐前胡素含量為限量指標不足以全面控制白芷質(zhì)量。
研究結(jié)果表明外標法和一測多評法測定白芷中5種香豆素成分的含量無顯著性差異,說明該方法不僅可用于白芷中5種香豆素類成分同時測定,還可以用來控制硫熏白芷的臨床安全性。采用一測多評法不僅對現(xiàn)有質(zhì)量控制方法有提升,而且還更快捷、可靠。