孫熙麟 蔣振彥 劉志屹 戴璐 孫非 黃偉

（1. 吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021；2. 吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，長(zhǎng)春 130021）

LZ-8（Lin Zhi-8）是從靈芝孢子中分離純化出來的一種具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的同源二聚體蛋白質(zhì)［1］，臨床前研究證實(shí)LZ-8 能夠有效抑制荷瘤小鼠體內(nèi)肺癌和肝癌的生長(zhǎng)［2-4］，具有極高的成藥潛質(zhì)。目前，人們已經(jīng)在畢赤酵母體內(nèi)重組表達(dá)了具有生物學(xué)活性的LZ-8 分子，并實(shí)現(xiàn)了LZ-8 分子中試規(guī)模的表達(dá)和純化［5］。然而，在LZ-8生產(chǎn)過程中，由于機(jī)械破碎、攪拌、錯(cuò)流式膜過濾等操作的存在，不可避免造成蛋白質(zhì)溶液局部升溫，引發(fā)蛋白質(zhì)解折疊乃至變性，嚴(yán)重影響了最終產(chǎn)物的效價(jià)和均質(zhì)性。因此，提高LZ-8 分子熱穩(wěn)定性，對(duì)于生產(chǎn)出質(zhì)量可靠，適用于臨床新藥申報(bào)的LZ-8 分子，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

隨機(jī)或定點(diǎn)突變是改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的常規(guī)方法，它們的基本原理都是使用新的氨基酸取代蛋白質(zhì)特定位置氨基酸，通過改變蛋白質(zhì)內(nèi)部相互作用進(jìn)而增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性［6-7］。隨機(jī)突變需要構(gòu)建大量隨機(jī)突變體，再根據(jù)突變體的熱穩(wěn)定性狀況，篩選出熱穩(wěn)定性改善的突變體［8］。而定點(diǎn)突變是基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，通過理性計(jì)算和分析待突變氨基酸位點(diǎn)，再通過定點(diǎn)或定點(diǎn)飽和突變技術(shù)改造蛋白的一種方法［9-12］?；诶硇杂?jì)算的定點(diǎn)突變技術(shù)在改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性方面有著廣泛應(yīng)用，在脂肪酶Lipase5、米根霉α-淀粉酶、胰蛋白酶等［13-15］分子上均有成功實(shí)例。因此，本項(xiàng)研究將選用基于理性計(jì)算的定點(diǎn)突變技術(shù)改善靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8 的熱穩(wěn)性。

1 材料與方法

1.1 材料

LZ-8 蛋白質(zhì)原液由長(zhǎng)春鉆智制藥有限公司提供，純度≥99.0%；畢赤酵母X33 菌株和pGAPZα-LZ-8 質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室自行保存樣本；Muta-directTM定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；胎牛血清（Bioin，以色列）、MEM 培養(yǎng)基（BI，以色列）購(gòu)自于上海逍鵬生物科技有限公司；WST-1 試劑盒購(gòu)自于日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 軟件及數(shù)據(jù)分析 從RCSB 網(wǎng)站（http：//www.rcsb.org/）下載LZ-8 晶體結(jié)構(gòu)文件3F3H.pdb，采用分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算軟件NAMD（Version 2.9）模擬升溫過程中LZ-8 全原子運(yùn)動(dòng)軌跡，具體參數(shù)：（1）模擬體系構(gòu)建：采用CHARMM 力場(chǎng)，選用TIP3P 八面體水分子盒模型，將蛋白質(zhì)分子置于10 ? 的水溶劑箱內(nèi)，加入Na+平衡電荷；（2）能量最小化：用sander 模塊進(jìn)行3000 步能量最小化，執(zhí)行最陡下降法500 步后轉(zhuǎn)位共軛梯度法，以消除不合理的能量勢(shì)壘；（3）加熱：對(duì)系統(tǒng)加熱使其從0 K 升溫至303 K、313 K 和323 K，并在保持體積不變的狀態(tài)下運(yùn)行50 ps 帶有位置限制的動(dòng)力學(xué)，將非鍵相互作用閾值設(shè)為8 ?，使用弱耦合的算法來控制溫度；（4）平衡：在常壓條件下系統(tǒng)分別處在303 K、313 K 和323 K條件下，進(jìn)行500 ps 的分子動(dòng)力學(xué)模擬，以平衡系統(tǒng)；（5）動(dòng)力學(xué)模擬：恒溫恒壓系統(tǒng)下進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，所用步長(zhǎng)為2 fs，以每1000 步采集一次能量與坐標(biāo)信息。分析動(dòng)力學(xué)模擬過程中結(jié)構(gòu)的均方根偏差值（Root mean square deviation，RMSD），再選擇RMSD 值平衡階段的數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)氨基酸的均方根漲落值（Root mean square fluctuation，RMSF），形成軌跡文件，最后通過VMD 軟件分析該模擬軌跡，計(jì)算不同環(huán)境溫度下LZ-8 分子的穩(wěn)態(tài)構(gòu)象。將LZ-8晶體結(jié)構(gòu)文件3F3H.pdb 輸入到軟件PyMOL（Version 2.3）中，根據(jù)氨基酸殘基B-Factor 數(shù)值的不同，以不同顏色標(biāo)示各氨基酸殘基，藍(lán)色表示該氨基酸穩(wěn)定性最高，紅色表示穩(wěn)定性最差。

1.2.2 LZ-8 分子定點(diǎn)突變 以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建質(zhì)粒pGAPZα-LZ-8 為模板，采用PCR 法對(duì)LZ-8 的核酸序列進(jìn)行F8W 和R9K 雙位點(diǎn)突變。設(shè)計(jì)PCR 點(diǎn)突變 引 物：M-f（5′- TCCGACACCGCTTTGATATGGAA GTTGGCATGGGAC-3′）和M-r（5′-GTCCCATGCCAA CTTCCATATCAAAGCGGTGTCGGA-3′），按 照MutadirectTM定點(diǎn)突變?cè)噭┖械牟僮髡f明，使用MutadirectTM酶對(duì)模板質(zhì)粒進(jìn)行全長(zhǎng)PCR，MutazymeTM酶再消化模板質(zhì)粒，剩余PCR 擴(kuò)增的全長(zhǎng)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取若干克隆，小量提取質(zhì)粒測(cè)序，將測(cè)序正確的突變質(zhì)粒擴(kuò)增后，按照文獻(xiàn)［16］報(bào)道的方法，轉(zhuǎn)化酵母X33 菌株，再進(jìn)行LZ-8 突變體蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。

1.2.3 HeLa 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 用含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基對(duì)本實(shí)驗(yàn)室凍存的HeLa 細(xì)胞株進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，按照1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入含2%胎牛血清MEM 培養(yǎng)基倍比稀釋的LZ-8 或LZ-8 突變體，每個(gè)蛋白質(zhì)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，選用WST-1 試劑測(cè)定細(xì)胞活力，450 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度，取復(fù)孔均值，應(yīng)用Prism（Version 6.0）軟件計(jì)算LZ-8 及LZ-8 突變體抑制HeLa 細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值。

1.2.4 樣品熱力學(xué)參數(shù)測(cè)定 差示量熱掃描分析儀MicroCal VP-DSC（通用電氣醫(yī)療，美國(guó)）測(cè)定LZ-8和LZ-8 突變體相變溫度Tm和相轉(zhuǎn)變焓值ΔH，實(shí)驗(yàn)參數(shù)：LZ-8 或LZ-8突變體樣品溶于0.01 M PBS緩沖液（pH7.2-7.4），終濃度1 mg/mL，進(jìn)樣體積500 μL，加熱范圍25-55℃，加熱速度1℃/min。采集原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用Origin 軟件分析樣品各熱力學(xué)參數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)量資料以x-±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 分子動(dòng)力學(xué)軟件模擬不同溫度下LZ-8穩(wěn)態(tài)構(gòu)象

采用NAMD 軟件計(jì)算系統(tǒng)溫度從0 K 升高至303 K（30℃）、313 K（40℃）和323 K（50℃）時(shí)LZ-8 單體全原子運(yùn)動(dòng)軌跡，VMD 軟件模擬出LZ-8單體在30℃、40℃和50℃三個(gè)溫度下的穩(wěn)態(tài)構(gòu)象（圖1）。在系統(tǒng)不斷升溫過程中，LZ-8 分子N-端α螺旋結(jié)構(gòu)變得不再穩(wěn)定，當(dāng)系統(tǒng)溫度上升到323 K（50℃）時(shí)，α 螺旋不但出現(xiàn)解螺旋，還發(fā)生顯著空間位移，提示N-端α 螺旋為L(zhǎng)Z-8 分子的溫度敏感區(qū)域。

圖1 不同溫度下LZ-8 的穩(wěn)態(tài)構(gòu)象

2.2 溫度因子B-factor預(yù)測(cè)LZ-8上熱敏感的氨基酸位點(diǎn)

溫度因子B-factor 常被用于反映氨基酸殘基在蛋白質(zhì)中的構(gòu)象狀態(tài)，B-factor 數(shù)值越高，模糊度越大，相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定或柔性越強(qiáng)。PyMOL 軟件根據(jù)B-factor 的不同，對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行色彩標(biāo)記。隨著B-factor 數(shù)值逐漸增大，標(biāo)記顏色逐漸由藍(lán)色、綠色、黃色轉(zhuǎn)變至橙色和紅色。根據(jù)溫度因子B-factor的預(yù)測(cè)，LZ-8 存在3 組溫度敏感位點(diǎn)（圖2），它們分別是：（1）N-端α 螺旋上第8 和第9 位氨基酸；（2）β4 片層和β5 片層之間LOOP 環(huán)上第63-71 位氨基酸；（3）β7 片層上的第103 和104 位氨基酸。其中，N-端α 螺旋是B-factor 和NAMD 分子模擬預(yù)測(cè)的共同溫度敏感區(qū)域，于是我們將待突變氨基酸位點(diǎn)定位到這一區(qū)域。

圖2 B-factor 預(yù)測(cè)LZ-8 的溫度敏感區(qū)域

2.3 LZ-8突變位點(diǎn)的選擇和設(shè)計(jì)

如圖2 所示，在LZ-8 分子N-端α 螺旋上，第8 位和第9 位氨基酸殘基B-factor 數(shù)值高于其它位置氨基酸殘基，推測(cè)它們比其它氨基酸殘基對(duì)溫度更為敏感，于是，選擇第8 位和第9 位氨基酸殘基進(jìn)行雙位點(diǎn)突變。已知，LZ-8 分子N-端α 螺旋結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)維持LZ-8 生物學(xué)活性至關(guān)重要，兩個(gè)LZ-8 單體分子通過各自N-端α 螺旋交互作用，形成有活性的二聚體分子，當(dāng)N 端α 螺旋結(jié)構(gòu)破壞或喪失時(shí)，LZ-8 生物學(xué)活性消失［17］。為確保LZ-8 雙位點(diǎn)突變后N-端α 螺旋結(jié)構(gòu)保持不變，于是按照氨基酸殘基極性相同，結(jié)構(gòu)相似的原則，將第8 位苯丙氨酸（F）替換為色氨酸（W），將第9 位精氨基酸（R）替換為賴氨酸（K）（圖3）。

圖3 LZ-8 氨基酸雙位點(diǎn)突變示意圖

2.4 LZ-8及LZ-8突變體抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)

LZ-8 具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，為檢測(cè)LZ-8 突變體是否保留了原LZ-8 分子的生物學(xué)活性，我們對(duì)LZ-8 和LZ-8 突變體同時(shí)進(jìn)行了HeLa 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（圖4）顯示，LZ-8 突變體與LZ-8 具有一致的抑制腫瘤生長(zhǎng)活性，兩者作用HeLa 細(xì)胞24 h 的IC50值分別為2.407 μg/mL 和2.238 μg/mL，表明氨基酸F8W 和R9K 雙位點(diǎn)突變沒有對(duì)LZ-8 結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性產(chǎn)生顯著影響。

圖4 LZ-8 及LZ-8 突變體對(duì)HeLa 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線（n=3）

2.5 LZ-8突變前后的熱力學(xué)參數(shù)

差示掃描量熱法通過測(cè)量以恒定速率加熱時(shí)與分子熱變性相關(guān)的熱能改變來表征分子的熱穩(wěn)定性。相變溫度Tm和相轉(zhuǎn)變焓值ΔH是表征分子穩(wěn)定性的兩個(gè)重要參數(shù)，Tm值越大，表示蛋白質(zhì)分子解折疊的溫度越高，ΔH值越大，表示蛋白質(zhì)分子解折疊的能壘越高，蛋白質(zhì)分子越穩(wěn)定。LZ-8 在生產(chǎn)及使用時(shí)均以溶液的形式存在，因此，我們應(yīng)用差示掃描量熱法對(duì)溶于PBS 緩沖液的LZ-8 和LZ-8 突變體進(jìn)行了熱力學(xué)參數(shù)分析（表1）。結(jié)果顯示，LZ-8突變體較LZ-8 相變溫度Tm上升0.92℃，相轉(zhuǎn)變焓值ΔH提高23.14 kJ/mol，兩者均顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，氨基酸F8W 和R9K 的雙位點(diǎn)突變改善了LZ-8 的熱穩(wěn)定性。

表1 LZ-8 及LZ-8 突變體的熱力學(xué)參數(shù)（n=3，x-±s）

3 討論

蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性一直是制藥業(yè)和酶工程領(lǐng)域研究熱點(diǎn)所在，目前，蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)被廣泛用于提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性［18-20］。根據(jù)提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性機(jī)制不同，蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)可采用如下幾種實(shí)施策略，如同源比對(duì)策略［21］、脯氨酸效應(yīng)設(shè)計(jì)策略［22］、SCHEMA 模擬法［23］和溫度因子設(shè)計(jì)策略［24］等。為精確定位LZ-8 溫度敏感氨基酸位點(diǎn)，該項(xiàng)目選擇了分子動(dòng)力學(xué)模擬和溫度因子預(yù)測(cè)兩種實(shí)施策略相結(jié)合的方法，進(jìn)行待突變氨基酸位點(diǎn)的選擇和設(shè)計(jì)。文中分子動(dòng)力學(xué)模擬了LZ-8 在3 個(gè)溫度節(jié)點(diǎn)下的穩(wěn)態(tài)構(gòu)象，通過觀測(cè)整體構(gòu)象在升溫過程中的動(dòng)態(tài)變化來明確了LZ-8 分子溫度敏感區(qū)域，即N-端α 螺旋，再在該區(qū)域內(nèi)借助溫度因子B-factor 進(jìn)一步確定溫度敏感氨基酸位點(diǎn)。這與其它應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬直接預(yù)測(cè)溫度敏感氨基酸位點(diǎn)的同類研究不同，其它研究多使用單一溫度下模擬的分子穩(wěn)態(tài)運(yùn)動(dòng)軌跡，計(jì)算被研究分子每個(gè)氨基酸的RMSF 值，再根據(jù)RMSF 值的大小判斷氨基酸構(gòu)象的穩(wěn)定性，這一算法通常會(huì)得到數(shù)量較多的候選突變位點(diǎn)，還需結(jié)合分子已有結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)進(jìn)一步縮小候選突變位點(diǎn)范圍［13］。因此，在結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)不夠完善的情況下，使用本文的“兩步走”策略更為適宜。

明確氨基酸突變位點(diǎn)后，需要選擇適宜的氨基酸對(duì)其進(jìn)行替換。定點(diǎn)飽和突變是選擇適宜突變氨基酸的方法之一，在該方法中研究人員需要針對(duì)待突變氨基酸構(gòu)建由其它19 種氨基酸分別取代的突變體文庫(kù)，再根據(jù)蛋白質(zhì)性能指標(biāo)對(duì)文庫(kù)內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行目標(biāo)篩選［25］。雖然該技術(shù)在富馬酸酶、脂肪酶/酯酶、細(xì)菌肽酶等［26-28］分子中成功實(shí)現(xiàn)了分子性能改善，但實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)的人力和物力仍是實(shí)際工作中需慎重考慮的因素。此外，研究人員還可以通過蛋白質(zhì)虛擬飽和突變軟件對(duì)目標(biāo)突變體進(jìn)行篩選，但該方法需要專門的軟件，并且軟件算法和參數(shù)設(shè)置不同，計(jì)算結(jié)果存在一定差異。本研究采用類似氨基酸策略，在LZ-8 的N-端α 螺旋內(nèi)，選取與待突變氨基酸：第8 位苯丙氨酸和第9 位精氨酸，極性相同、結(jié)構(gòu)類似的色氨酸（F8W）和賴氨酸（R9K）進(jìn)行氨基酸替換，獲得了溫度穩(wěn)定性提高LZ-8 突變體。較比苯丙氨酸和精氨酸，色氨酸的強(qiáng)疏水性，以及賴氨酸的高穩(wěn)定性是新突變體熱穩(wěn)定提高的潛在原因。誠(chéng)然，在本研究中沒有構(gòu)建F8W 和R9K 單獨(dú)突變的突變體，因此尚無法從實(shí)驗(yàn)角度判別F8W 和R9K 各自給LZ-8 熱穩(wěn)定性帶來的影響，這部分工作有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

分子動(dòng)力學(xué)模擬和B-factor 因子的聯(lián)合預(yù)測(cè)能夠有效定位LZ-8 分子的溫度敏感區(qū)域。按照氨基酸極性相同，結(jié)構(gòu)相似的原則，對(duì)LZ-8 分子N-端α螺旋進(jìn)行的F8W 和R9K 雙位點(diǎn)突變，在保證LZ-8突變前后N-端α 螺旋結(jié)構(gòu)及抗腫瘤生物學(xué)活性不變的前提下，有效提高了LZ-8 分子熱穩(wěn)定性，有利于LZ-8 的生產(chǎn)、運(yùn)輸和存儲(chǔ)。