殷金瑤 王義 徐良向 朱利 王晨 劉文波 繆衛(wèi)國

（海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游的DNA序列，提供RNA 聚合酶識別和結(jié)合位點(diǎn)，是調(diào)控基因表達(dá)強(qiáng)弱的重要元件，通過參與基因的轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)來調(diào)控基因表達(dá)的水平、部位及方式［1-2］。研究表明，通過自身啟動子在植物中對外源基因進(jìn)行功能表達(dá)，為植物生物技術(shù)中有益轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用提供了可能，如提高植物脅迫耐受性等［3］。

目前，最經(jīng)典的啟動子是花椰菜花葉病毒（CaMV）35S 啟動子［4］、玉米泛素（Ubiquitin）啟動子［5］和水稻肌動蛋白（ACT1）啟動子［6］等。但隨著應(yīng)用不斷深入，上述幾個啟動子的缺陷也不斷暴露出來，如因高效表達(dá)需要產(chǎn)生的大量能耗會對植物生長產(chǎn)生影響，引起植物生長緩慢［7］。同時因其表達(dá)具有持續(xù)性，不隨時間和空間的變化而變化，在植物體內(nèi)表達(dá)不具有特異性［8］，因而人們開始尋求更加高效、優(yōu)質(zhì)的啟動子。

有研究表明，使用絲狀真菌中的強(qiáng)啟動子可以高效啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄。在絲狀真菌中利用自身啟動子起始轉(zhuǎn)錄外源基因的轉(zhuǎn)錄效率通常很高，但是一些外源蛋白的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于內(nèi)源蛋白的產(chǎn)量［9］。有文獻(xiàn)報(bào)道，啟動子活性、翻譯效率、蛋白糖基化、目標(biāo)基因的拷貝數(shù)以及菌株自身蛋白酶的降解能力等均會影響蛋白的產(chǎn)量，其中以啟動子轉(zhuǎn)錄水平的高低影響最為關(guān)鍵，使用強(qiáng)啟動子可以實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)［10-11］。目前已報(bào)道的絲狀真菌啟動子主要是曲霉葡糖淀粉酶基因（glaA）啟動子，構(gòu)巢曲霉的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（gpdA）啟動子，米曲霉的a-淀酶基因（amyB）啟動子，瑞氏木霉纖維二糖水解酶基因（cbh1）啟動子［12］。

橡膠樹白粉菌（Oidium heveae）引起的橡膠樹白粉病是橡膠生產(chǎn)中重要病害之一［13］。在前期研究中，我們首次報(bào)道了橡膠樹白粉菌基因組［14］，構(gòu)建了適于快速檢測橡膠樹白粉菌菌株HO-73 啟動子的探針載體［15］，并通過將啟動子與CaMV35S 啟動子及ACT1 啟動子的活性比較，初步鑒定了WY7［16］、WY51［17］、WY193［18］等能夠用于調(diào)控雙子葉植物和單子葉植物中的外源目的基因表達(dá)的橡膠樹白粉菌內(nèi)源啟動子。本研究中通過對其基因組進(jìn)行分析，預(yù)測篩選了一些疑似內(nèi)源啟動子的核心區(qū)域，并通過克隆得到了其中1 個疑似新的內(nèi)源啟動子WY172（BankIt2158599，另文發(fā)表）。本研究以WY172 上游2K 序列為研究對象，通過利用生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行檢索并預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，通過構(gòu)建不同長度疑似具有啟動子活性片段的表達(dá)載體，觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況，探討WY172 及4 個不同長度缺失片段的表達(dá)活性，旨在尋求更好的可服務(wù)于基因工程、應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的優(yōu)秀啟動子。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹白粉菌菌株HO-73 篩選、保存于本實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)于橡膠苗中感品種熱研7-33-97［19］上，培養(yǎng)室內(nèi)溫度為25℃恒溫，光周期為14 h/10 h（光/暗），濕度范圍88%左右。模式生物三生煙（Nicotiana tabacumcv.Xanthi nc）作為研究對象，培養(yǎng)于上述培養(yǎng)室中。

1.2 方法

1.2.1 WY172 啟動子生物信息學(xué)分析 Promoter Scan 預(yù)測橡膠樹白粉菌全基因組DNA，得到若干橡膠樹白粉菌疑似內(nèi)源啟動子的核心區(qū)域，將其中一個命名為WY172（BankIt2158599），并利用在線數(shù)據(jù)庫EPD 確認(rèn)所驗(yàn)證的啟動子是否為未報(bào)道的新啟動子。利用在線數(shù)據(jù)庫PROMO 對WY172 上游2K序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析，利用在線生物信息學(xué)軟件JASPAR 檢索相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在序列上的分布位置對WY172上游2K 序列進(jìn)行漸變?nèi)笔蛔?，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5 設(shè)計(jì)5′端不同缺失的上游引物和3′端下游引物。同時通過plantCARE 軟件對WY172 啟動子上游2K 序列的作用元件進(jìn)行分析。

1.2.2 WY172 啟動子及不同長度片段的克隆 提取橡膠樹白粉菌基因組DNA（OMEGA，D3390），以此為模板，通過上游特異引物172F、172Q1F、172Q2F、172Q3F、172QF 和共同的下游引物172NR進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得5 種不同長度的啟動子片段。

將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收。將回收產(chǎn)物與T-easy 載體連接，進(jìn)行TA克隆，并轉(zhuǎn)化Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp 抗性的LB固體培養(yǎng)基（100 μg/mL），37℃過夜培養(yǎng)16 h。挑取單菌落于Amp 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的陽性克隆菌株送華大生物公司測序。測序正確的菌株用80%的甘油保菌。

1.2.3 WY172 啟動子及不同長度片段瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建 選擇HindIII/BamH I 分別酶切并回收pBI121 載體和1.2.2 中的含不同長度片段的克隆載體，進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Kan 抗性的LB 固體培養(yǎng)基（100 μg/mL），37℃培養(yǎng)16 h。挑取單菌落于Kan 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培過夜后進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，正確的陽性克隆菌株送華大生物公司測序，測序正確的菌株用80%的甘油保菌。

1.2.4 三親雜交法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株 挑選含有目的基因的大腸桿菌菌株，在含有50 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)（帶有CaMV35S 啟動子的pBI121 載體作為陽性對照），至OD600nm為0.5時，與LBA4404、HB101 感受態(tài)等體積混勻，涂布于不含任何抗生素的LB 固體培養(yǎng)基上，28℃過夜培養(yǎng)。用接種針將長出的菌落轉(zhuǎn)移到含有100 μg/mL利福霉素和50 μg/mL 卡那霉素的固體LB 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3-4 d，長出單菌落。將長出的單菌落再次轉(zhuǎn)移到含有100 μg/mL 利福霉素和50 μg/mL 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，挑選單斑在含有50 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL 利福霉素的LB 液體培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR 檢測，正確的陽性克隆菌株送華大生物公司測序，測序正確的菌株用80%的甘油保菌。

1.2.5 GUS 染色 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法（ATMT）侵染三生煙，將侵染后的煙草葉盤28℃共培養(yǎng)2 d后取樣，每個片段啟動子取6 片葉盤浸泡于GUS 染色液［20］中，37℃過夜培養(yǎng)，后將樣品轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色至葉片組織無色，觀察。

1.2.6 GUS 酶活性測定 取各樣品0.1 g 液氮研磨，提取植物總蛋白（CWBIO，Plant Protein Extraction Reagent），-80℃保存。GUS 蛋白濃度的測定采用BCA 法（Solarbio，BCA Protein Assay），使用多功能酶標(biāo)儀Infinie 200 PRO 測定樣品在562 nm 處的吸光值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。采用Jefferson 等［21］報(bào)道的方法測定GUS 蛋白活性，結(jié)果以生成的4-甲基傘形酮（4-methylumbelliferon，4-MU）的量與總蛋白的量和時間的比值（pmol 4-MUG/mg protein/min）來表示。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)。最后使用SPSS 軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 WY172啟動子生物信息學(xué)分析

在線數(shù)據(jù)庫EPD 確認(rèn)未發(fā)現(xiàn)與WY172 同源的啟動子。對轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測分析結(jié)果顯示W(wǎng)Y172啟動子上游2K 序列上共有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)17 個（表1），運(yùn)用IBS 軟件繪制基因圖譜（圖1），直觀地展示出各個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在基因上的位置，為后續(xù)缺失突變位置的確定提供參考。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在序列上的分布位置，以不切斷轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)為原則，設(shè)計(jì)了4 個缺失突變片段，分別 為WY172Q（2250 bp）、WY172Q1（1551 bp）、WY172Q2（1281 bp） 和WY172Q3（871 bp）（ 圖2）。結(jié)合前期研究得到的WY172 啟動子（251 bp），通過Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)了6 個引物（表2）。PlantCARE 軟件分析結(jié)果（表3）顯示，其上游2K序列含有豐富的作用元件，包括光響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、創(chuàng)傷誘導(dǎo)元件、厭氧感應(yīng)元件、參與柵欄葉肉細(xì)胞分化的元件及玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)的順式作用元件等。

2.2 WY172啟動子及不同長度片段的克隆

通過PCR 及產(chǎn)物膠回收，成功獲得5 個帶有酶切位點(diǎn)的不同長度片段，并構(gòu)建了Teasy-WY172、Teasy-WY172Q、Teasy-WY172Q1、Teasy-WY172Q2、Teasy-WY172Q3 共5 個載體，菌液PCR 結(jié)果顯示出與目的片段大小基本一致的條帶（WY172Q 為2300 bp 左右，WY172Q1 為1500 bp 左 右，WY172Q2 為1300 bp 左 右，WY172Q3 為800 bp 左 右，WY172為250 bp 左右）。并經(jīng)過華大生物公司測序及NCBI比對結(jié)果顯示序列相似性為100%，說明成功克隆了WY172 啟動子及不同長度片段。

表1 WY172 啟動子上游2K 序列含有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

圖1 WY172 啟動子上游2K 序列轉(zhuǎn)錄因子分布圖

表2 引物序列

2.3 WY172啟動子及不同長度片段瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建

陽性克隆菌株的菌液PCR 結(jié)果顯示獲得與目的條帶大小一致的片段，華大公司測序結(jié)果經(jīng)過比對顯示DNA 相似性為100%，獲得了重組的植物表達(dá) 載 體pBI121-WY172、pBI121-WY172Q、pBI121-WY172Q1、pBI121-WY172Q2、pBI121-WY172Q3（以pBI121 載體作為陽性對照），同時通過Vector NT1繪制了植物表達(dá)載體示意圖（圖2-A），并利用IBS軟件繪制了WY172 啟動子不同長度片段特征示意圖（圖2-C）。將5 個重組植物表達(dá)載體通過三親雜交法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，菌液PCR 檢測結(jié)果顯示出與目的基因大小一致的特異片段（圖2-B）（WY172Q 為2300 bp 左右，WY172Q1 為1500 bp 左右，WY172Q2 為1300 bp 左 右，WY172Q3 為800 bp 左 右，WY172為250 bp 左右），經(jīng)過華大生物公司測序及NCBI 比對結(jié)果顯示序列相似性為100%，說明獲得了含有各缺失片段啟動子的農(nóng)桿菌菌株。

表3 WY172 啟動子上游2K 序列含有的作用元件

圖2 不同長度啟動子片段及載體構(gòu)建

2.4 GUS蛋白染色

GUS 染色結(jié)果（圖3）顯示，所有菌株瞬時表達(dá)的葉盤都成功染出了藍(lán)色，其中陽性對照菌株（pBI121 載體）侵染的葉盤染色最淺，而WY172 不同片段菌株侵染的葉盤染色深度均強(qiáng)于陽性對照。pBI121-WY172Q3 葉盤染色最深，顏色由深至淺排列是：pBI121-WY172Q3＞ pBI121-WY172Q2＞ pBI121-WY172Q1＞ pBI121-WY172＞ pBI121-WY172Q，總體呈現(xiàn)隨長度增長GUS 染色顏色逐漸變淺的趨勢，但WY172Q3 片段出現(xiàn)藍(lán)色顯著加深現(xiàn)象。結(jié)果表明，WY172 啟動子的5 個不同長度片段均能啟動GUS基因的表達(dá)，其中WY172Q3 的表達(dá)活性最強(qiáng)。

圖3 不同長度啟動子片段煙草瞬時表達(dá)的GUS 染色

2.5 GUS酶活性檢測

為測定不同長度片段的酶活性，繪制了BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線和4-MU 標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2值分別為0.9995 和0.9998，達(dá)到了測定要求（圖4）。SPSS 軟件統(tǒng)計(jì)酶活性分析結(jié)果（圖5）顯示，野生型幾乎檢測不到酶活性，而CaMV35S 啟動子和5 個WY172 不同長度片段啟動子均具有驅(qū)動GUS基因表達(dá)的酶活性，GUS 酶活性趨勢為：WY172Q3＞ WY172Q2＞W(wǎng)Y172Q1＞ WY172＞ WY172Q＞ CaMV35S，總體呈現(xiàn)隨長度的增長活性逐漸遞減趨勢，但在WY172Q3處酶活性出現(xiàn)顯著回升。酶活性檢測結(jié)果與GUS 染色結(jié)果一致，再次證明WY172 啟動子的5 個不同長度片段均具有啟動子活性，WY172Q3 表達(dá)活性最強(qiáng)。

圖4 BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線和4-MU 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 不同長度啟動子片段煙草瞬時表達(dá)的GUS 酶活性

3 討論

通過對不同長度啟動子的表達(dá)活性進(jìn)行分析可以得知啟動子發(fā)揮作用的能力［22-23］，為充分解讀其對基因的調(diào)控表達(dá)過程及后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。橡膠樹白粉菌是一種專性寄生菌，分子研究嚴(yán)重落后，啟動子方面的研究更是少之又少［24］。目前，已見報(bào)道的研究多集中于啟動子的篩選和鑒定。本實(shí)驗(yàn)室前期通過不同卡那霉素濃度下啟動子的耐受性大小來篩選強(qiáng)啟動子，并以橡膠樹白粉菌基因組為研究對象，鑒定出多個在單子葉和雙子葉植物中均能表達(dá)的強(qiáng)啟動子。在此研究的基礎(chǔ)上，本研究聚焦于WY172 啟動子不同長度片段驅(qū)動外源基因表達(dá)的能力，以WY172 啟動子上游2K 序列為研究對象，進(jìn)行漸變?nèi)笔蛔儯治霾煌悟?qū)動GUS基因的表達(dá)活性。

本研究經(jīng)過初步分析發(fā)現(xiàn)WY172 啟動子上游2K 序列含有豐富的順式作用元件，其中有參與創(chuàng)傷反應(yīng)的WUN-motif 作用元件，厭氧感應(yīng)的ARE 順式作用元件，參與葉肉細(xì)胞柵欄組織分化的HD-Zip1元件，參與玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)的O2-site 順式作用元件，以及參與晝夜控制的circadian 順式作用元件等功能作用元件，還有茉莉酸甲酯響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、生長素響應(yīng)等激素作用元件，此外還有低溫響應(yīng)、光響應(yīng)元件等非生物因素的作用元件。這表明WY172 啟動子很可能在植物生長的各個階段都能發(fā)揮作用，多樣性的元件也為下一步高效表達(dá)外源基因的啟動子的開發(fā)提供了可能，為WY172 啟動子的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

GUS 染色結(jié)果及酶活性檢測表明，在調(diào)控GUS基因表達(dá)方面，WY172 啟動子的不同長度片段都具有比CaMV35S 啟動子強(qiáng)的啟動子活性。CaMV35S啟動子是目前國際上應(yīng)用最廣、活性最強(qiáng)的啟動子之一，但隨著研究的深入，該類啟動子在應(yīng)用上的不足已經(jīng)顯現(xiàn)地越來越明顯［25］。WY172 啟動子的不同長度片段均具有比CaMV35S 啟動子更強(qiáng)的活性，這為基因工程工具的開發(fā)提供另外一個可能性。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將會對WY172 啟動子的具體類型及應(yīng)用范圍等進(jìn)行分析，以便為基因工程開發(fā)一個更有效的啟動子工具。

順式作用元件的種類和數(shù)量的不同，以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的差異，都有可能影響基因的表達(dá)效果。活性分析結(jié)果顯示，WY172 不同片段的活性強(qiáng)弱關(guān)系為WY172Q3＞ WY172Q2＞ WY172Q1＞W(wǎng)Y172＞ WY172Q＞ CaMV35S。WY172Q3 段 啟 動 子表達(dá)活性升高可能是由于在251 bp-821 bp 區(qū)段含有轉(zhuǎn)錄激活元件，使得該區(qū)段具有顯著增強(qiáng)效應(yīng)；WY172Q2 段啟動子區(qū)段也有增強(qiáng)效應(yīng)但表達(dá)活性低于251 bp-821 bp 段的原因，一個可能是821 bp-1281 bp 區(qū)段含有的激活元件種類和數(shù)量都少于WY172Q3 段，也可能是821 bp-1281 bp 區(qū)段同時含有抑制表達(dá)元件，與251 bp-821 bp 區(qū)段中的一部分激活元件的功能相抵了；WY172Q1 段啟動子及WY172Q 段啟動子表達(dá)活性降低，可能是由于1281 bp-2250 bp 區(qū)段含有抑制表達(dá)元件，導(dǎo)致了抑制效應(yīng)。未來，我們將會對具體的抑制、激活元件進(jìn)行定位及探究，從而研究該啟動子不同情況下的表達(dá)量變化。

我們的啟動子來源于絲狀真菌，這類真菌表達(dá)外源蛋白的量比較低［26］，為實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，通常需要強(qiáng)大的啟動子來驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄，但目前針對絲狀真菌啟動子的研究與應(yīng)用比較少，主要是木霉屬（Trichoderma）和黑曲霉屬（Aspergillus niger）的一些啟動子［27］。除此之外，絲狀真菌啟動子大部分都只能應(yīng)用于自身菌體中外源基因的表達(dá)，而來源于橡膠樹白粉菌的WY172 啟動子不僅具有絲狀真菌啟動子的優(yōu)點(diǎn)，還可以應(yīng)用于植物，這為其推廣和應(yīng)用提供了更大的可能。為后續(xù)對于其下游基因和調(diào)控方式的確定提供方向、奠定基礎(chǔ)，同時從一定程度上也促進(jìn)了橡膠樹白粉菌的分子系統(tǒng)發(fā)育和形態(tài)學(xué)分析研究工作。

4 結(jié)論

本研究克隆了WY172 啟動子及其4 個不同長度的缺失片段，并構(gòu)建了植物表達(dá)載體，通過GUS染色和酶活性檢測，對啟動子表達(dá)活性進(jìn)行了定性和定量分析。證明以上WY172 啟動子5 個不同長度片段均具有啟動子活性，均能驅(qū)動GUS基因的表達(dá)。GUS 染色結(jié)果顯示W(wǎng)Y172 啟動子不同長度片段的藍(lán)色強(qiáng)度均優(yōu)于陽性對照CaMV35S 啟動子，其中WY172Q3 驅(qū)動GUS基因表達(dá)的酶活性最高。且酶活性檢測也與GUS 染色結(jié)果相符。不同片段的缺失對表達(dá)活性的影響不同，pBI121-WY172Q3 啟動子表達(dá)活性最強(qiáng)。