王亞利 康春曉 楊傳臻 魏藝璇 王瑞飛，2 李明軍，3 楊清香，2

（1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007；2. 資源微生物與功能分子河南省高校重點實驗室培育基地（河南師范大學(xué)），新鄉(xiāng)，453007；3. 河南省道地藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心/綠色藥材生物技術(shù)河南省工程實驗室，新鄉(xiāng) 453007）

地黃在我國有悠久的藥用歷史，臨床上多用于強(qiáng)心、利尿、鎮(zhèn)痛、降血糖及保護(hù)肝臟等方面。近年來的研究顯示，地黃很可能在抗腫瘤、抗過敏及免疫調(diào)節(jié)方面也具有潛在的藥用價值［1］。優(yōu)質(zhì)地黃的生產(chǎn)受到地理條件的巨大限制，河南省焦作地區(qū)因為具備適合地黃生長的良好土壤和氣候條件，被認(rèn)為是地黃的道地產(chǎn)區(qū)，種植面積將近1.5 萬hm2，產(chǎn)值達(dá)數(shù)10 億元。但是，地黃在生長過程中受到多種病害如斑枯病、病毒病和根腐病等的極大威脅。其中，根腐?。菸。┲饕：Φ攸S根部和莖部，發(fā)病初期，植株靠近地面的根莖和葉柄部分首先出現(xiàn)黃褐色腐爛斑，然后葉片逐漸萎蔫，最終導(dǎo)致地黃死亡。地黃根腐病的發(fā)病率通常在10%-20%，嚴(yán)重時高達(dá)80%，是道地地黃產(chǎn)量和質(zhì)量急劇下降的主要原因之一，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，地黃根腐病病原的研究對于地黃質(zhì)量和產(chǎn)量的提高均具有十分重要的現(xiàn)實意義。

病原性微生物大量繁殖和傳播直接誘發(fā)了地黃根腐病的發(fā)生。較早的報道認(rèn)為真菌中鐮刀霉屬的一些成員是地黃根腐病發(fā)生的主要致病微生物［2-3］，但是，近些年的研究發(fā)現(xiàn)，除了鐮刀霉外，還有其它多種微生物如真菌立枯絲核菌和惡疫霉等［4］也與地黃根腐病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，造成地黃根腐病的病原菌并未完全被認(rèn)識。除此之外，大量的研究表明，溫度、pH、營養(yǎng)等環(huán)境條件對植物病原微生物的生長和致病性有顯著的影響［5-9］。例如，Nemergut 等［10］指出，夏季高溫，植物代謝旺盛，向土壤中釋放大量根際分泌物而刺激微生物繁殖；冬季低溫，適寒性微生物則大量繁殖。國春菲等［11］研究表明在鹽漬地中pH 值越高土壤細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)越低，當(dāng)pH 為10 時土壤中的Pycnidiophorasp.，Sordarialessp.，Aspergillus versicolor等 菌 屬消 失， 而Emericellopsis terricola，F(xiàn)usarium solani，Verticillium dahliaestrain F724 等菌屬出現(xiàn)。本實驗室以前的研究發(fā)現(xiàn)，地黃在生長過程中通常會分泌大量酚酸類物質(zhì)到其根際土壤中。這些酚酸類物質(zhì)將使地黃根際土壤pH 降低，導(dǎo)致土壤中微生物群落由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變［12-14］。同時，不能利用或耐受酚酸的微生物逐漸被淘汰，這進(jìn)一步導(dǎo)致土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的失衡和病原性真菌的生長［15～17］。

圍繞地黃病原微生物的研究，前人已取得了一定的進(jìn)展，但是導(dǎo)致地黃根腐病發(fā)生的病原學(xué)問題尚未完全清楚。本研究通過傳統(tǒng)分離純化方法對未知根腐病病原菌（尤其是病原真菌）進(jìn)行分離，并通過回接試驗確定其致病能力。進(jìn)一步，對病原微生物的生長的最佳溫度、pH、酚酸（地黃根部分泌物阿魏酸、對羥基苯甲酸和香草酸）耐受能力等生物學(xué)特征進(jìn)行深入闡明，以期為地黃根腐病的控制奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar Medium，PDA）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15-20 g，蒸餾水1000 mL，自然pH；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）：10 g 酵母膏，20 g 蛋白胨，20 g 葡萄糖，蒸餾水1000 mL，若制固體培養(yǎng)基，加入20 g 瓊脂粉。

供試菌株：海洋紅酵母Rhodotorula paludigenaDH5 由發(fā)病地黃中分離純化得到，保存于河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境與資源微生物實驗室。

儀器：Olympus BX51 顯微鏡，日本Olympus 公司，Thermo 酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；生長曲線測定儀。

1.2 方法

1.2.1 病害懷地黃塊根的采集 2015 年8 月，在河南省溫縣采集地黃塊根，此時為地黃根腐病高發(fā)期。選取具有典型根腐病癥狀的地黃植株，挖取其塊根放入無菌采樣袋，置于冰盒中，帶回實驗室進(jìn)行致病真菌分離。

1.2.2 地黃根腐病病原真菌的分離純化 取發(fā)病腐爛的懷地黃塊根，用流水沖洗掉表面雜質(zhì)。在無菌條件下，將塊根置于75%乙醇中浸泡3 min。用無菌水中沖洗5-7 次后，將最后沖洗水涂布在PDA 平板上。培養(yǎng)3-5 d 檢驗是否將塊根表面的微生物清除干凈。將塊根放在滅過菌的吸水紙上晾干。無菌條件下，按照常規(guī)組織分離［18］，將塊根切成體積約1 cm3小塊，擺放在PDA 固體平板上，28℃培養(yǎng)5 d。劃線分離至少3 次，直至平板上只有一種形態(tài)的菌落，顯微鏡下觀察確認(rèn)是否為單一菌株。

1.2.3 分離純化所得菌株的鑒定

1.2.3.1 菌株的形態(tài)特征及顯微鏡觀察 將真菌培養(yǎng)5 d 后，無菌條件下從菌落邊緣挑取適量菌絲，制成水浸片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其特征。

1.2.3.2 所篩菌株的分子生物學(xué)鑒定 從培養(yǎng)的單菌落上挑取適量的菌體，用TaKaRa 微生物細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，以細(xì)胞裂解液為模板，以ITS 序列通用引物ITS1、ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［19］。引物序列如下：

ITS1（5′-TCCGTTAGGTGAACCTGCGG-3′），ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

引物由上海生工公司合成。PCR 反應(yīng)體系為Mix 12.5 μL，無菌雙蒸水9.9 μL，模板1 μL，前后引物各0.8 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35 個循環(huán)的擴(kuò)增（94℃/30 s，54℃/30 s，72℃/1 min），最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。將目的片段的PCR 產(chǎn)物送到上海生工公司進(jìn)行測序，利用BLAST 與GenBank 數(shù)據(jù)庫中真菌ITS序列進(jìn)行比對分析，通過MEGA4.1 軟件對同源序列以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列進(jìn)行多重序列比對，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定菌株的分類水平。

1.2.4 致病性檢測 分離所得的酵母菌用YPD 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，調(diào)整濃度至2×107個/mL［20］。將121℃，2 h 高壓蒸汽滅菌的土壤分裝于花盆中，取大小基本一致的健康懷地黃塊根，清洗干凈，用酒精棉球蘸取75%的酒精擦拭表面，放入花盆中。取10 mL 準(zhǔn)備好的菌液施加到地黃塊根附近，用土壤將懷地黃塊根完全埋住，用滅過菌的四層紗布包嚴(yán)花盆的上口，防止外源微生物的污染。將花盆搬到室溫30℃的無菌室中，期間不間斷澆水以保持花盆中土壤的濕度。待懷地黃塊根發(fā)病后，再以發(fā)病塊根組織為材料分離微生物，確認(rèn)是否能分離得到施加進(jìn)去的微生物。

1.2.5 生物學(xué)特性研究

1.2.5.1 溫度對菌生長的影響 從YPD 固體平板上挑取單個菌落接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，在28℃恒溫?fù)u床上以180 r/min 轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h，吸取1 mL 菌液接種到100 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，分別于19℃、28℃、37℃恒溫?fù)u床上以180 r/min 培養(yǎng)，并設(shè)置3 個重復(fù)，每2 h 測一次菌液的OD600nm，然后取平均值。

1.2.5.2 pH 對菌生長的影響 從YPD 固體平板上挑取單個菌落接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，在28℃恒溫?fù)u床上以180 r/min 轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h，吸取10 μL 菌液接種到290 μLYPD 液體培養(yǎng)基中，其pH 分別為3、5、7 和9，于28℃恒溫?fù)u床上以180 r/min 培養(yǎng)，并設(shè)置3 個重復(fù)，每8 h 測一次菌液的OD600nm，然后取平均值。

1.2.5.3 酚酸對菌生長的影響 從YPD 固體平板上挑取單個菌落接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，在28℃恒溫?fù)u床上以180 r/min 轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h，吸取10 μL 菌液接種到290 μL YPD 添加酚酸的液體培養(yǎng)基中，其中酚酸種類為香草酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸，培養(yǎng)基酚酸組合的類型一共7 種，分別為只有3 種單酚酸、3 種兩酚酸組合和1 種三酚酸組合，酚酸總濃度均為0.01 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L，設(shè)置3 個重復(fù)，并每8 h 測一次菌液的OD600nm，然后取平均值。

2 結(jié)果

2.1 根腐病病原菌的分離純化及形態(tài)特征

2015 年8 月，從種植地黃土地中采集發(fā)生根腐病的地黃塊根，如圖1-A 中箭頭所示，塊根呈棕黑色腐爛。按照材料方法所述分離根腐病病原真菌，從發(fā)病塊根周圍共挑取潛在致病菌6 株，其中一株呈現(xiàn)特殊的色澤。對該菌進(jìn)一步的分離純化顯示，該菌菌落橙黃色，邊緣整齊，表面光滑、濕潤。顯微鏡檢測顯示，菌體橢圓形，有疑似出芽現(xiàn)象。因此，初步判定其可能為酵母菌。該菌菌落及顯微形態(tài)如圖1-B、C 所示。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將所得菌株的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，初步確定其目的基因大小，然后進(jìn)行ITS 測序。測序結(jié)果提交到GENEBANK（ID：MF359557）。Blast 比對結(jié)果顯示，該菌與紅酵母屬中的Rhodotorula paludigena具有100%的相似度。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，該酵母菌與Rhodotorula paludigena簇集在一起，置信度為91，遺傳距離最近，具有密切的親緣關(guān)系。因此，初步鑒定該菌株為Rhodotorula paludigena，命名為Rhodotorula paludigenaDH5（圖2）。

圖1 懷地黃根腐病病原菌的分離及顯微形態(tài)（10×40）

2.3 Rhodotorula paludigena DH5的致病性檢測

所得酵母菌Rhodotorula paludigenaDH5 對地黃塊根的致病能力通過持續(xù)20 d 的回接實驗進(jìn)行驗證，在第10 天和第20 天時分別將懷地黃塊根挖出來拍照（圖3）。對照組地黃塊根在回接后的第10天和第20 天，均未發(fā)現(xiàn)明顯的根腐病表型。接種Rhodotorula paludigenaDH5 的地黃塊根在第10 天時開始呈現(xiàn)輕微的棕黑色病變點，第20 天時，呈現(xiàn)出明顯的棕黑色腐爛。20 d 后，將所有的地黃塊根挖出，統(tǒng)計致病率，結(jié)果（表1）顯示，所有接種Rhodotorula paludigenaDH5 的地黃塊根均發(fā)生了明顯的根腐病癥狀。通過平板分離、菌落形態(tài)觀察、顯微鏡觀察及ITS 測序，從腐爛塊根中，重新分離到了接種的酵母菌菌株Rhodotorula paludigenaDH5，證明該酵母菌確實具有導(dǎo)致地黃根腐病發(fā)生的能力。

圖2 基于ITS 序列構(gòu)建Rhodotorula paludigena DH5 的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 生物學(xué)特性研究結(jié)果

2.4.1 溫度對Rhodotorula paludigenaDH5 生長的影響 在不同溫度下，該菌生長情況有很大的差異。如圖4 所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，Rhodotorula paludigenaDH5 在28℃條件下的OD 值總體呈現(xiàn)明顯上升，而在37℃和19℃條件下培養(yǎng)液的OD 值呈現(xiàn)明顯下降。尤其是在接種9 h 后，Rhodotorula paludigenaDH5 在28℃條件下的OD 值高于其在37℃和19℃條件下的OD 值，差異達(dá)到極顯著水平。因此，Rhodotorula paludigenaDH5 的生長最適溫度為28℃，溫度過高或過低均會抑制該菌的生長。

2.4.2 pH 對Rhodotorula paludigenaDH5 生 長 的 影響 在不同的pH 值條件下，Rhodotorula paludigenaDH5 的生長速度存在較大的差異。如圖5 所示，pH為3、5、7、9 時，隨著生長時間的延長，培養(yǎng)液的OD 值總體保持增高的趨勢。其中，當(dāng)培養(yǎng)液的 pH為5 時，培養(yǎng)液的OD 值增長最快，在24 h 后，其OD 值達(dá)到1.252，遠(yuǎn)高于pH 為3、7、9 時的OD 值。這些結(jié)果表明，該致病菌適合在微酸條件下生長，在過酸或堿性條件下均不利于其快速生長。

2.4.3 酚酸對Rhodotorula paludigenaDH5 生長的影響 我們首先檢測了地黃根際土壤中3 種常見酚酸在單一或聯(lián)合作用下對菌株生長的影響。由圖6 可見，隨著生長時間的延長，不同濃度的阿魏酸、對羥基苯甲酸和香草酸單獨存在對Rhodotorula paludigenaDH5的生長均產(chǎn)生一定的抑制作用。但是，即使在最高0.5 g/L 的濃度下生長48 h 后，該菌株在3 種單一酚酸培養(yǎng)液的OD 值仍能達(dá)到1.6 以上（對照為1.767）。這些結(jié)果表明，Rhodotorula paludigenaDH5 對單一酚酸具有良好的耐受能力。

圖3 Rhodotorula paludigena DH5 對懷地黃塊根的致病性

表1 Rhodotorula paludigena DH5 的致病性檢測

圖4 不同的溫度對酵母菌的影響

圖5 不同的pH 對酵母菌生長的影響

混合酚酸對Rhodotorula paludigenaDH5 生長影響如圖7 所示。當(dāng)混合酚酸培養(yǎng)液中同時存在兩種或3 種酚酸（酚酸濃度分別為0.01 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L 和0.5 g/L） 時，Rhodotorula paludigenaDH5的生長均受到一定程度的抑制，但是仍能保持較高的生長速率。值得注意的是，在培養(yǎng)16 h 后，Rhodotorula paludigenaDH5 在混合酚酸濃度為0.5 g/L 的香草酸和對羥基苯甲酸混合培養(yǎng)液中的OD 值（0.556-1.369）總體上低于其在單純對羥基苯甲酸（0.605-1.665）或香草酸培養(yǎng)液中的OD 值（0.546-1.535），但是其在3 種酚酸組合培養(yǎng)液中的OD 值（0.696-1.680）卻高于其在香草酸/對羥基苯甲酸組合培養(yǎng)液中的OD 值。推測在0.5 g/L 時，香草酸和對羥基苯甲酸組合對Rhodotorula paludigenaDH5 生長的抑制表現(xiàn)為疊加效應(yīng)，但是阿魏酸的加入將抵消這種協(xié)同作用。

3 討論

根腐病是主要危害植物根及莖部的一類嚴(yán)重病害。該病易傳染、高致死、難防治。因此，根莖類中藥一旦感染該疾病，往往出現(xiàn)大面積死亡和減產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在本研究中，我們分離獲得了一株酵母菌，經(jīng)測序及遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)其與Rhodotorula paludigena具有高達(dá)100%的相似性，經(jīng)回接試驗證實，該酵母菌能夠有效的侵染地黃根部，導(dǎo)致根腐病的發(fā)生。

圖6 不同濃度的單種酚酸對酵母菌生長的影響

早期的研究顯示，植物根腐病的發(fā)生主要與真菌鐮刀霉屬的一些成員如腐皮鐮刀霉及尖孢鐮刀菌等密切相關(guān)［21］。但是，除了鐮刀霉外，其它的微生物也極有可能參與了根腐病的發(fā)生過程。如王立新等［22］從黃芪根部分離到立枯絲核菌、尖鐮孢菌和腐皮鐮孢菌，并證明這些菌株均能導(dǎo)致黃芪根腐病的發(fā)生；羅文富等［23］從三七腐爛根部分離到的假單胞菌，接種到三七根部，顯著提高了三七根腐病的發(fā)病率。在地黃根腐病的研究中，已有的報道顯示，腐皮鐮刀菌是主要的根腐病病原菌，其它病原微生物如立枯絲核菌和惡疫霉等也已經(jīng)被分離到。在本研究中，初步證實了Rhodotorula paludigenaDH5 能夠引起地黃根腐病。

酚酸類物質(zhì)是地黃根部分泌物的主要成分之一。已有的研究表明，一些微生物的生長會受到酚酸類物質(zhì)的影響。比如，酚酸改變pH 值，使根際微生物群落發(fā)生失衡，細(xì)菌與放線菌數(shù)量下降，真菌數(shù)量上升［24-25］。在失衡的微生物群落中，一些病原性微生物往往能夠利用酚酸類物質(zhì)作為碳源進(jìn)行生長并成為根際微生物群落的主要微生物類群，導(dǎo)致植物疾病的發(fā)生更為嚴(yán)重［15～16］。以前的報道顯示，頭茬地黃根際土壤中存在多種不同酚酸，其中常見的有對羥基苯甲酸，香草酸和阿魏酸。本研究中，我們檢測了這3 種酚酸對Rhodotorula paludigenaDH5生長的影響。結(jié)果表明，酵母菌能夠在單一酚酸或混合酚酸的高濃度培養(yǎng)液（酚酸總濃度為0.5 g/L）中很好生長，證明該病原微生物對酚酸具有良好的耐受性。這種耐受性可能與該酵母菌能夠利用這些酚酸作為碳源或適應(yīng)酚酸類物質(zhì)所誘發(fā)的pH 改變密切相關(guān)。值得注意的是，我們的結(jié)果進(jìn)一步顯示，該酵母菌在濃度為0.5 g/L 的香草酸和對羥基苯甲酸混合培養(yǎng)液中的生長速率比其在單純對羥基苯甲酸或香草酸培養(yǎng)液中的生長速率低，但是，其在3 種酚酸組合培養(yǎng)液中的生長速率卻高于其在香草酸和對羥基苯甲酸組合培養(yǎng)液中的生長速率。以前的報道顯示，多種酚酸混合在一起會出現(xiàn)協(xié)同、加合和拮抗作用等，其對土壤根際微生物生長的影響比單一酚酸作用更為明顯。例如，劉萍等［26］發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸、苯甲酸和鄰苯二甲酸對炭疽病菌的生長有拮抗作用。母容等［27］發(fā)現(xiàn)阿魏酸和對羥基苯甲酸對土壤中的氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌有協(xié)同抑制作用。而且，不同研究組的報道表明，酚酸間的互作效能表現(xiàn)為協(xié)同增效還是拮抗與各種酚酸之間的濃度水平密切相關(guān)：較低濃度時，各種酚酸之間協(xié)同增效；當(dāng)提高到一定濃度時，協(xié)同增效效應(yīng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓剐?yīng)［28］。因此，我們分離所得病原性酵母對混合酚酸的良好耐受性，可能受到不同酚酸間協(xié)同效應(yīng)的影響。其具體的機(jī)制仍待進(jìn)一步的研究確定。

圖7 不同濃度的組合酚酸混合對該菌株生長的影響

4 結(jié)論

本研究從腐爛的地黃塊根中分離獲得一菌株DH5。經(jīng)形態(tài)學(xué)及ITS 序列同源性分析初步鑒定該菌株與Rhodotorula paludigena具有密切的親緣關(guān)系。回接實驗證實，菌株DH5 可以導(dǎo)致地黃根部腐爛。生物學(xué)特性分析展示，菌株DH5 的最適生長溫度為28℃，最適pH 為5，而且其對單一或混合酚酸具有很好的耐受性，最高耐受濃度可達(dá)0.5g/L。