吳航 李智強(qiáng) 劉文德

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的一種真菌病害，可導(dǎo)致水稻的大面積減產(chǎn)，產(chǎn)量損失在10%-30%，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)甚至絕收。有研究表明，全球每年因稻瘟病而損失的糧食可以養(yǎng)活大約6000 萬(wàn)人口［1］。近年來(lái)，稻瘟病菌的致病機(jī)理已成為研究熱點(diǎn)。對(duì)稻瘟病菌侵染結(jié)構(gòu)的研究表明：隔膜蛋白Sep3 的GTPases 通過(guò)改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)形成侵染釘，促進(jìn)5.9 μm 環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成，環(huán)狀結(jié)構(gòu)和F-actin 共同定位在附著胞孔周圍，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的彎曲和侵染釘?shù)漠a(chǎn)生，促進(jìn)稻瘟病菌的侵染［2］。稻瘟病菌侵染水稻過(guò)程中，多種信號(hào)傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了稻瘟病菌和水稻相互作用，如絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinase，MAPK）途徑、環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）途徑和鈣離子信號(hào)途徑。稻瘟病菌中的MAPK 途徑主要有3 種：Pmk1，Mps1 和Osm1［3-5］。另有研究表明：鈣離子信號(hào)途徑參與稻瘟病菌生長(zhǎng)、侵染和致病力的形成。例如，受鈣調(diào)磷酸酶調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子CRZ1 缺失突變體會(huì)導(dǎo)致分生孢子形成率降低和致病力的減弱［6］。cAMP 途徑也參與稻瘟病菌附著胞的形成，腺苷酸環(huán)化酶Mac1基因缺失突變體不能形成附著胞［7］。

在病原物與植物相互作用的分子機(jī)制中，由病原物引起的植物防衛(wèi)免疫反應(yīng)可以分為兩個(gè)層次［8-9］。包括模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor，PRRs）識(shí)別而引起的免疫防衛(wèi)反應(yīng)（PAMP-Triggered Immunity，PTI）［10］與 病 原 物 效應(yīng)蛋白激發(fā)引起的免疫防衛(wèi)反應(yīng)（Effector triggered immunity，ETI）［11］。在PTI 中，植物的模式識(shí)別受體PRRs（如EFR 和 FLS2）識(shí)別病原菌的病原相關(guān)分子模式PAMPs（如elf18/elf26 和flg22）引起植物一系列生理生化反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)植物自身抗性［12］。ETI 產(chǎn)生比PTI 更快速和強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，并引起植物的細(xì)胞死亡。例如，水稻的Pi-ta 蛋白C 端的富含亮氨酸區(qū)域（Leucine-rich domain，LRD）和稻瘟病菌的AvrPita 專化性直接結(jié)合，引起Pi-ta 介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)［13］。稻瘟病菌的效應(yīng)蛋白AvrPiz-t 抑制RING-finger 類型泛素連接酶APIP6 的泛素化活性，從而抑制PTI 反應(yīng)［14］。

植物病原物分泌的效應(yīng)蛋白可以促進(jìn)病原物的侵染，探究病原菌效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化，明確其在致病過(guò)程中的作用，具有重要科學(xué)意義。研究表明：細(xì)菌通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲ secretion system，T3SS）分泌多種效應(yīng)蛋白進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)引起非寄主植物的過(guò)敏性反應(yīng)或寄主植物的抗性反應(yīng)［15］；真菌的吸器不僅是吸取和交換營(yíng)養(yǎng)的結(jié)構(gòu)，也是分泌效應(yīng)蛋白的首要位點(diǎn)［16］；卵菌的吸器不僅是專化性的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，也是效應(yīng)蛋白的分泌位點(diǎn)［17］。

第一個(gè)被克隆的稻瘟病菌效應(yīng)蛋白Pwl2 是在研究稻瘟病菌侵染彎葉畫(huà)眉草（Eragrostis curvula）的過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)的［18］。Pwl2 同源蛋白Pwl1 同樣可以阻止稻瘟病菌對(duì)彎葉畫(huà)眉草的侵染［19］。在水稻原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)Avr1-CO39 引起Pi-CO39?；赃^(guò)敏性反應(yīng)，表明Pi-CO39 特異識(shí)別Avr1-CO39［20-21］。稻瘟病菌MC69基因編碼一個(gè)假定的分泌蛋白，MC69缺失的突變體的致病力下降，但對(duì)附著胞形成沒(méi)有影響。在附著胞形成以后，MC69的缺失突變體不能形成侵染菌絲，因此，效應(yīng)蛋白MC69在稻瘟病菌致病過(guò)程中有重要作用［22］。

對(duì)稻瘟病菌分泌效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和其在致病過(guò)程中的作用的研究，可為植物與病原菌協(xié)同進(jìn)化和植物病害的防治提供理論依據(jù)。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，篩選到能誘導(dǎo)非寄主植物細(xì)胞死亡的稻瘟病菌候選效應(yīng)蛋白MoCDIE2，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)生物信息學(xué)分析。然后構(gòu)建MoCDIE2的敲除突變體，并對(duì)其生長(zhǎng)表型與致病性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究MoCDIE2 的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用煙草材料為本生煙草，水稻材料為感病品種CO39，稻瘟病菌Guy11 菌株，農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105 均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物抗病功能基因研究組保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻培養(yǎng) 將水稻種子浸泡于盛有水的培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h 后瀝干，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 催芽至種子破胸露白。將出芽的種子播種到盛有營(yíng)養(yǎng)土的小方盒里，每盒6-9 粒種子。

1.2.2 煙草注射與瞬時(shí)表達(dá) 將目的基因的瞬時(shí)表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105。轉(zhuǎn)化后的EHA105 菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基，28℃ 210 rpm條件下培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的菌液離心，用侵染液［10 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L MES（pH=5.7），200 μmol/L 乙酰丁香酮］重新懸浮菌塊并調(diào)整菌液濃度至OD600=1.5。將目的基因的農(nóng)桿菌菌液與P19菌液（OD600=1.0）等體積混合。室溫條件下黑暗靜置重懸的菌液3 h。使用1 mL 注射器將混合后的菌液注射到生長(zhǎng)期為4-5 周的煙草葉片上，注射液浸潤(rùn)葉片面積為80%，并用記號(hào)筆標(biāo)下注射范圍。

1.2.3 RNA 提取和qRT-PCR 用TRIzol 法提取稻瘟病菌Guy11 的菌絲總RNA，使用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega 生物公司）獲得cDNA，稀釋cDNA 作為qRT-PCR 模板。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)中使用的PCR 引物（表1）由Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，并由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

本實(shí)驗(yàn)使用全式金公司的TranStart Top Green qPCR SuperMix（+Dye Ⅰ）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，以稻瘟病菌Actin 基因（MGG_03982）為內(nèi)參基因，并使用ABI Prism7500儀器完成，按照2-ΔΔct計(jì)算表達(dá)量。

1.2.4 Split PCR 方法構(gòu)建MoCDIE2基因敲除突變體 根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）提供的基因組序列，以稻瘟病菌菌株Guy11的基因組DNA 為模板，MoCDIE2-LBCK/MoCDIE2-LB-R 和MoCDIE2-RBCK/ MoCDIE2-RB-F 為 引 物 進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增MoCDIE2上下游2 kb 序列LB和RB。以第一輪的PCR 產(chǎn)物的100 倍稀釋液為模板，LB-F/HYG-R1 和RB-R/HYG-F1 為引物擴(kuò)增LB+HY和YG+RB 片段。將LB+HY 和YG+RB 片段的PCR產(chǎn)物混合后轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌原生質(zhì)體中。經(jīng)潮霉素平板抗性壓力篩選得到轉(zhuǎn)化子，并提取轉(zhuǎn)化子的DNA 和RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的鑒定。

1.2.5MoCDIE2突變體的表型分析 從野生型Guy11 和突變體菌落邊緣打孔取同等大小的圓形菌塊接菌到CM（Complete medium）固體培養(yǎng)基上，28℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d 后觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)并測(cè)量菌落直徑。

1.2.6MoCDIE2突變體致病力檢測(cè) 培養(yǎng)稻瘟病菌菌株Guy11 和突變體菌株，25℃條件下持續(xù)光照至產(chǎn)生足夠的孢子數(shù)。用0.05%的Tween-20 水溶液洗脫孢子，調(diào)整孢子懸浮液濃度至5×104個(gè)/mL。將制備的孢子懸浮液均勻噴施在“三葉一心”期的水稻葉片上。噴施結(jié)束，用透明薄膜密封黑暗處理24 h，再光照5-7 d 后，統(tǒng)計(jì)病害發(fā)生情況。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP 檢索，獲得19 個(gè)與MoCDIE2 高度同源的氨基酸序列，用CLUSTAL W 比對(duì)分析，進(jìn)而用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 MoCDIE2基因的生物信息學(xué)分析

在稻瘟病菌中，預(yù)測(cè)大約有1306 個(gè)基因編碼分泌蛋白［23-24］。實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)基因組表達(dá)譜，MPSS［25-26］，RL-SAGE［27］和SBS［28］3 種 技 術(shù)鑒定出851 個(gè)稻瘟病菌侵染水稻過(guò)程中表達(dá)的分泌蛋白［29］。選取其中一個(gè)分泌蛋白（MGG_03356，MoCDIE2）作為候選效應(yīng)蛋白，搜索比對(duì)稻瘟病菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)MoCDIE2的cDNA 全長(zhǎng)為1068 bp，編碼一個(gè)含有355 個(gè)氨基酸的蓖麻毒素B凝集素蛋白（Ricin B lectin protein）。利用MoCDIE2的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)搜索，發(fā)現(xiàn)其在19 個(gè)真菌物種中均有同源性較高的蛋白，再利用Clustal W 比對(duì)分析MoCDIE2 及其同源性最高的其它19 個(gè)蛋白氨基酸序列，最后用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析MoCDIE2 與其它19 個(gè)蛋白氨基酸序列的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。同源蛋白對(duì)比分析表明：MoCDIE2 與子囊菌門(mén)的根腐病菌（Monosporascus ibericus）、炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、痂囊腔菌（Elsinoe australis）的同源性高達(dá)82%、80%和75%。在MoCDIE2 的19 個(gè)同源性最高的真菌蛋白中，大多來(lái)源于子囊真菌，個(gè)別屬于擔(dān)子菌，如：灰蓋鬼傘菌（Coprinopsis cinerea）和羽瑚菌（Pterula gracilis）（圖1）。這說(shuō)明MoCDIE2 同源蛋白保守存在于真菌物種中。利用DNAMAN 進(jìn)行MoCDIE2 和另外4 個(gè)絲狀真菌中的同源蛋白氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：MoCDIE2 在絲狀真菌中具有高度的保守性，并且蛋白氨基酸數(shù)目相差不大（圖2）。

2.2 MoCDIE2在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)

圖1 MoCDIE2 和其它物種中同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

圖2 MoCDIE2 和其它物種中同源氨基酸序列比對(duì)分析

為了篩選能誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的效應(yīng)蛋白，將MoCDIE2構(gòu)建到植物瞬時(shí)表達(dá)載體pGDR 質(zhì)粒，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將MoCDIE2表達(dá)載體注射到煙草葉片上進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，同時(shí)設(shè)置BAX 和空載pGDR 注射的煙草葉片分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，注射后觀察煙草葉片表型。結(jié)果表明：72 h 后，在對(duì)照組中，陽(yáng)性對(duì)照BAX 表達(dá)載體注射的煙草葉片有嚴(yán)重細(xì)胞死亡現(xiàn)象，陰性對(duì)照pGDR 和P19 表達(dá)載體注射的煙草葉片未出現(xiàn)細(xì)胞死亡。在實(shí)驗(yàn)組，MoCDIE2 的瞬時(shí)表達(dá)載體注射72 h 后，煙草葉片發(fā)生明顯皺縮的細(xì)胞死亡現(xiàn)象（圖3）。結(jié)果表明：MoCDIE2 的瞬時(shí)表達(dá)能引起非寄主植物煙草葉片的細(xì)胞死亡，而細(xì)胞死亡是植物限制植物病原物生長(zhǎng)的一種防御機(jī)制，推測(cè)MoCDIE2 可能在植物-植物病原物相互作用過(guò)程中起重要作用。

圖3 MoCDIE2 在煙草葉片細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)

2.3 MoCDIE2基因敲除突變體的獲得

為構(gòu)建MoCDIE2敲除突變體，進(jìn)一步分析其功能，我們利用Split-PCR 方法（圖4-A）擴(kuò)增MoCDIE2上下游片段和HYG 片段，再利用PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將LB+HY 和RB+YG 片段混合轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌Guy11 原生質(zhì)體中，RT-PCR 驗(yàn)證MoCDIE2敲除轉(zhuǎn)化子。PCR 結(jié)果表明：由LB-F/H YG-R1 擴(kuò)增得到2488 bp 的LB+HY 的條帶，由RBR/HYG-F1 擴(kuò)增得到2250 bp 的RB+YG 的條帶（圖4-B）；進(jìn)一步RT-PCR 驗(yàn)證，使用引物MoCDIE2-F/MoCDIE2-R 在轉(zhuǎn)化子2、3、5 和Guy11 中能擴(kuò)增出條帶，而在陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子1、4 和6 中不能擴(kuò)增出條帶（圖4-C），說(shuō)明成功獲得3 個(gè)具有潮霉素抗性的MoCDIE2基因敲除突變體，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分別命名為MoCDIE2-KO1、MoCDIE2-KO2 和MoCDIE2-KO3。

2.4 MoCDIE2表型鑒定

2.4.1 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng) 在CM 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)稻瘟病菌的野生型菌株Guy11 和3 個(gè)MoCDIE2基因的敲除菌株MoCDIE2-KO1、MoCDIE2-KO2 和MoCDIE2-KO3，一周后觀察菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)：敲除突變體和野生型菌株在CM 平板上的生長(zhǎng)速率未見(jiàn)差異，突變體和野生型的菌落形態(tài)無(wú)明顯變化（圖5-A）。通過(guò)測(cè)量野生型Guy11 和MoCDIE2基因的敲除突變體的菌落并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明：突變體和野生型的菌落直徑?jīng)]有顯著差異（圖5-B）。因此，MoCDIE2基因可能不直接參與調(diào)控稻瘟病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。

2.4.2 致病性測(cè)定 將野生型菌株Guy11 和MoCDIE2基因的敲除菌株分別接種到燕麥固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)孢后，將野生型菌株Guy11 和MoCDIE2基因的敲除菌株的孢子懸浮液調(diào)整濃度至5×104個(gè)/mL，噴霧接種到水稻葉片上，7 d 后觀察水稻葉片的發(fā)病情況、病斑大小和病斑數(shù)量等。結(jié)果（圖5-C）表明：MoCDIE2的敲除菌株和野生型菌株均能導(dǎo)致接種后的水稻葉片產(chǎn)生典型稻瘟病病斑，且病斑大小和數(shù)量沒(méi)有明顯的差異。因此，MoCDIE2基因的缺失對(duì)稻瘟病菌的致病性沒(méi)有影響。

3 討論

在植物和病原物的相互作用中，效應(yīng)蛋白在促進(jìn)病原物成功侵染和抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)方面都起重要調(diào)控作用［30］。因此采取合適策略分離和克隆效應(yīng)蛋白對(duì)植物病原物的效應(yīng)蛋白功能研究以及明確病原物與植物之間的相互作用機(jī)制有重要意義。

在已被鑒定到的稻瘟病菌效應(yīng)蛋白中，Pwl1［19］、Pwl2［18］和AvrPiz-t［31］等都是通過(guò)圖位克隆策略分離克隆得到。圖位克隆是根據(jù)與目的效應(yīng)蛋白基因緊密連鎖的分子標(biāo)記在染色體上的位置，通過(guò)構(gòu)建遺傳連鎖群體以及篩選基因組文庫(kù)等步驟逐步確定和分離目的基因的方法。圖位克隆策略的優(yōu)點(diǎn)是未知基因的序列信息和基因表達(dá)產(chǎn)物的序列、結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息的條件下，可以獲得該基因。因此，圖位克隆作為一個(gè)重要分離克隆未知基因的技術(shù)手段，為探索未知效應(yīng)蛋白的功能提供技術(shù)支持。在這一策略中，最重要的因素是開(kāi)發(fā)與目的效應(yīng)蛋白基因緊密連鎖的分子標(biāo)記以及細(xì)菌人工染色體（Bacterium artificial chromosome，BAC）或酵母人工染色體（Yeast artificial chromosome，YAC）等基因組文庫(kù)的構(gòu)建。但是傳統(tǒng)的圖位克隆策略實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不夠高效，操作步驟繁瑣。在完成了稻瘟病菌全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，借助植物異源表達(dá)系統(tǒng)瞬時(shí)表達(dá)候選效應(yīng)蛋白為更加快速地克隆目標(biāo)效應(yīng)蛋白提供了技術(shù)支持。

本研究應(yīng)用高效的由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的異源表達(dá)策略篩選稻瘟病菌效應(yīng)蛋白。將候選效應(yīng)蛋白構(gòu)建到pGDR 表達(dá)載體，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)策略快速、有效地初步鑒定效應(yīng)蛋白的功能。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單，周期短的優(yōu)點(diǎn)。利用生物信息學(xué)分析技術(shù)結(jié)合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，我們成功篩選到一個(gè)能誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的效應(yīng)蛋白，相比較于圖位克隆策略中的周期長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)，異源表達(dá)策略能快速的篩選到誘導(dǎo)非寄主植物細(xì)胞死亡的效應(yīng)蛋白。高效便捷地篩選到誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的效應(yīng)蛋白，可以為后續(xù)效應(yīng)蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)提高研究的效率。但如何保證效應(yīng)蛋白表達(dá)載體的順利轉(zhuǎn)化與穩(wěn)定表達(dá)是異源表達(dá)策略需要面對(duì)的問(wèn)題。首先，通過(guò)制備活性較高的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞是提高效應(yīng)蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵之一。其次，煙草植株的選擇也是提高效應(yīng)蛋白表達(dá)載體表達(dá)效率的重要因素。在進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的過(guò)程中，需要注意植物的生長(zhǎng)狀態(tài)，選取健康煙草植株，因?yàn)檩^大或老的煙草葉片不利于效應(yīng)蛋白表達(dá)載體的注射和滲透，從而會(huì)導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定，影響細(xì)胞死亡表型的觀察。

圖4 MoCDIE2 敲除突變體的構(gòu)建與驗(yàn)證

在本實(shí)驗(yàn)中，能誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的MoCDIE2基因編碼一個(gè)蓖麻毒素B 凝集素蛋白。蓖麻毒素蛋白是由A、B 兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵連接的一種劇毒植物糖蛋白。蓖麻毒素蛋白的A 鏈在B 鏈的協(xié)助下，穿透細(xì)胞膜并破壞細(xì)胞核蛋白體60S 亞蛋白，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在蓖麻毒素的B 鏈上有3 個(gè)重要的半乳糖結(jié)合位點(diǎn)，因此通過(guò)特異性抑制B 鏈的結(jié)合位點(diǎn)，可能阻斷細(xì)胞死亡的發(fā)生。有研究表明：蓖麻毒素能夠誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡而引起細(xì)胞死亡，并且檢測(cè)到被蓖麻毒素處理后的細(xì)胞的線粒體膜電位發(fā)生了顯著變化［32］。因此，MoCDIE2 引起的細(xì)胞死亡可能和植物細(xì)胞線粒體膜電位的變化有關(guān)，在后續(xù)的研究中，可以檢測(cè)細(xì)胞的線粒體膜電位，進(jìn)一步明確MoCDIE2 引起的細(xì)胞死亡的作用機(jī)制。

在本實(shí)驗(yàn)中，與野生型相比，MoCDIE2敲除突變體對(duì)稻瘟病菌的營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)和對(duì)水稻的致病性方面沒(méi)有顯著差異，可能是效應(yīng)蛋白的功能冗余性造成的。其次，MoCDIE2 可能不直接參與調(diào)控稻瘟病菌的生長(zhǎng)，也不直接參與水稻的致病過(guò)程，但MoCDIE2 或許在侵染過(guò)程中與其他未知的效應(yīng)蛋白發(fā)生作用，進(jìn)而導(dǎo)致某些生理生化過(guò)程的發(fā)生。稻瘟病菌中存在著1000 多個(gè)分泌蛋白，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)分泌蛋白都沒(méi)有功能注釋，敲除或過(guò)表達(dá)某一單個(gè)分泌蛋白基因，并不足以影響稻瘟病菌的致病性。這是因?yàn)樵诘疚敛【锌赡艽嬖谄渌δ芟嗨频囊粋€(gè)或一類基因繼續(xù)行使其功能，從而繼續(xù)保持稻瘟病菌的生長(zhǎng)和致病特性，多數(shù)功能冗余的效應(yīng)蛋白存在于稻瘟病菌中，為效應(yīng)蛋白的功能研究帶來(lái)了困難和挑戰(zhàn)。

圖5 稻瘟病菌MoCDIE2 的功能分析

4 結(jié)論

本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)篩選到稻瘟病菌的分泌蛋白MoCDIE2（MGG_03356）能誘導(dǎo)非寄主植物煙草細(xì)胞死亡。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：MoCDIE2 編碼一個(gè)蓖麻毒素B 凝集素蛋白，在子囊菌門(mén)的根腐病菌（M. ibericus）、炭疽病菌（C.gloeosporioides）、痂囊腔菌（E. australis）均存在高度同源蛋白，其同源蛋白也存在于其他16 種絲狀真菌中，并具有高度的保守性。通過(guò)Split-PCR 和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)構(gòu)建MoCDIE2敲除突變體，獲得了3 個(gè)MoCDIE2的敲除突變體。進(jìn)一步對(duì)MoCDIE2功能分析表明：MoCDIE2基因的缺失不影響稻瘟病菌的生長(zhǎng)和對(duì)水稻的致病性。