張睿珠 江羽宸 黃俊 閆潔

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832000）

天然橡膠（Natural rubber，NR）是植物類異戊二烯代謝途徑中一種重要的次生代謝產(chǎn)物，其彈性、延展性、散熱性等性能都優(yōu)于合成橡膠。因此，NR 作為一種重要的能源物質(zhì)，在國民經(jīng)濟(jì)和國防建設(shè)中有至關(guān)重要的作用。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是NR 原料的主要來源，但存在種植地域局限性、真菌易感性及收割工作的繁瑣性等問題。為滿足天然橡膠逐年上升的需求量，各國政府和跨國公司都將尋找NR 替代資源列入戰(zhàn)略計(jì)劃中［1］。

在已探明的2500 多種產(chǎn)膠植物中，橡膠草（Taraxacum kok-saghyzRodin） 和 銀 色 橡 膠 菊（Parthenium argentatumL.）產(chǎn)膠的相對分子質(zhì)量較大，能夠滿足工業(yè)應(yīng)用需求。其中，橡膠草適應(yīng)性強(qiáng)、生長周期短、適合機(jī)械化種植和采收，是理想的天然橡膠替代資源，具有極高的開發(fā)價(jià)值；又因其基因組相對簡單，遺傳轉(zhuǎn)化與基因編輯較為容易，可作為科學(xué)研究的模式植物。李家洋研究組運(yùn)用PacBio 單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)（SMRT）組裝完成了高質(zhì)量的橡膠草基因組草圖，為天然橡膠研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［2］。

橡膠粒子是天然橡膠生物合成與貯存的重要場所，根據(jù)其直徑的不同可分為小橡膠粒子（Small rubber particles，SRPs）和大橡膠粒子（Large rubber particles，LRPs）。橡膠粒子的膜蛋白，如橡膠轉(zhuǎn)移酶（Rubber transferase，HRT）、橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF）和小橡膠粒子蛋白（SRP protein，SRPP），是橡膠生物合成的關(guān)鍵酶或蛋白因子［3-6］。所有的REF 和SRPP 蛋白都有一個(gè)REF保守結(jié)構(gòu)域，不同的是大部分SRPPs 家族成員位于SRPs，SRPPs 蛋白家族N 端較短，且有一個(gè)可變C 端。橡膠草基因組共編碼五個(gè)TkSRPP 蛋白，相關(guān)研究表明，TkSRPP3、TkSRPP4和TkSRPP5基因在膠乳中的表達(dá)量較高［7］。通過抑制TkSRPP3基因的表達(dá)，橡膠草根中的乳膠含量和橡膠相對分子質(zhì)量均顯著降低［8］。由此可見，SRPP 在維持橡膠粒子穩(wěn)定和天然橡膠合成等方面都有重要作用。

SRPP基因在橡膠樹乳管細(xì)胞中高水平表達(dá)，SRPP 是催化和調(diào)控橡膠生物合成的重要蛋白因子［9］。為探究SRPP2 蛋白在橡膠草中的作用，本研究通過提取橡膠草RNA，反轉(zhuǎn)錄得到橡膠草cDNA全長，克隆橡膠草小橡膠粒子蛋白（SRPP2）基因，并命名為TkSRPP2。運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對該基因序列進(jìn)行同源性分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，構(gòu)建細(xì)胞融合表達(dá)載體，并進(jìn)行煙草亞細(xì)胞定位預(yù)測，為深入研究TkSRPP2基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆野生型（Wild Type，WT）橡膠草（Taraxacum kok-saghyzRodin）無菌苗由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1TkSRPP2的克隆 利用李家洋課題組公布的橡膠草基因組數(shù)據(jù)，運(yùn)用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)TkSRPP2基因引物，用TkSRPP2-F 和TkSRPP2-R（表1）；以橡膠草cDNA 為模板，克隆橡膠草TkSRPP2基 因。PCR 體 系：10 μL Mix；8 μL ddH2O；1 μL cDNA；0.5 μLTkSRPP2-F；0.5 μLTkSRPP2-R。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸60 s，35 個(gè)循環(huán)。

1.2.2TkSRPP2生物信息學(xué)分析 利用NCBI 中的Blast 數(shù)據(jù)庫，獲得15 條相似度較大的CDS 序列，利用MTGA7.0 對所得序列進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用Vector NTI Advance 11 獲得TkSRPP2基因的氨基酸序列，使用在線生物軟件ExPASY ProtParam tool、SOPMA secondary structure prediction、SWISS-MODEL 等在線軟件分析其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)并構(gòu)建其三維蛋白模型。利用SignalP3.0Server（http：//http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）預(yù)測信號肽，使用在線軟件WoLF PSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）對TkSRPP2 蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。通過NCBI 中的Blastp 工具對TkSRPP2 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測分析TkSRPP2 蛋白的跨膜區(qū)。

1.2.3 細(xì)胞融合表達(dá)載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物并命名為Y-TkSRPP2-F 和Y-TkSRPP2-R（表1），克隆去終止子且?guī)в蠿hoLI 和BamHI 兩個(gè)酶切位點(diǎn)的TkSRPP2基因。PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1 min；94℃變 性15 s，62℃退 火15 s，72℃延 伸60 s，35 個(gè)循環(huán)?；厥盏玫降哪康钠闻c細(xì)胞融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行重組子篩選鑒定，獲得細(xì)胞融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFPTkSRPP2。

1.2.4 煙草表皮細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 參照于小帆等［10］的植物亞細(xì)胞定位方法，采用注射法進(jìn)行煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)的亞細(xì)胞定位。煙草注射菌液后在22-24℃下培養(yǎng)48 h。將處理后煙草葉片使用酶解法制備原生質(zhì)體，共聚焦顯微鏡觀察TkSRPP2 蛋白質(zhì)的定位。

1.2.5 橡膠草TkSRPP2基因的時(shí)空表達(dá)分析 研究基于已公布的橡膠草基因組數(shù)據(jù)，選取穩(wěn)定的GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因［11］，用Primer5.0 設(shè)計(jì)引物，分 別 命 名 為q-TkSRPP2-F、q-TkSRPP2-R（表1）。提取6 月齡橡膠草不同組織及不同生長期橡膠草植株根部RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測6 月齡橡膠草不同組織及不同生長期橡膠草TkSRPP2基因表達(dá)量的差異。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果

2.1 TkSRPP2基因的克隆與分析

以橡膠草cDNA 為模板，根據(jù)橡膠草全基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異引物TkSRPP2-F 和TkSRPP2-R，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示：在大約633 bp 處有單一的特異條帶，片段大小與理論值相符，將所得片段測序，測序結(jié)果與已公開基因序列相符，將其命名為TkSRPP2。

圖1 TkSRPP2 基因的克隆

2.2 TkSRPP2基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 TkSRPP2 蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測與分析 通過NCBI中的Blastp 工具對TkSRPP2 氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示TkSRPP2 蛋白均具有一個(gè)REF 超家族保守結(jié)構(gòu)域。經(jīng)在線生物軟件ExPASY ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）分析可以得出，TkSRPP2 蛋白共有210 個(gè)氨基酸；理論分子量為23.15 kD；理論等電點(diǎn)為8.51，屬于堿性蛋白；不穩(wěn)定性系數(shù)為41.02，屬于不穩(wěn)定蛋白；平均親水性為-0.180，為親水性蛋白。在線軟件SOPMA 預(yù)測TkSRPP2 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其主要由66.19%α 螺旋構(gòu)成，其次為26.19%無規(guī)則卷曲、4.29% β-轉(zhuǎn)角。利用SWISS-MODEL 軟件構(gòu)建其三維蛋白模型（圖2）。TkSRPP2 蛋白沒有跨膜區(qū)，不屬于跨膜蛋白。SignalP3.0Sever 預(yù)測TkSRPP2 蛋白質(zhì)沒有信號肽，不屬于分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明TkSRPP2 蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。

圖2 TkSRPP2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建TkSRPP2基因編碼的氨基酸序列經(jīng)BLAST 比對，與萵苣（Lactuca sativa）、黃 花 蒿（Artemisia annua）、 向 日 葵（Helianthus annuus）、 洋 薊（Cynara cardunculus var. scolymus）、短角蒲公英（Taraxacum brevicorniculatum）等的抗脅迫蛋白或小橡膠粒子蛋白具有同源性，相似度均在90%以上。運(yùn)用MEFA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）表明，TkSRPP2 氨基酸序列與萵苣SRPP3 親緣關(guān)系最近。

2.3 細(xì)胞融合表達(dá)載體

將去終止子的目的基因片段與克隆載體pMD19T 連接， 以此獲得重組質(zhì)粒pMD19-TTkSRPP2。將測序鑒定正確的 pMD19-T-TkSRPP2重組質(zhì)粒和細(xì)胞融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP同時(shí)用XbaⅠ和BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取抗性篩選平板上的單菌落，做菌落PCR 鑒定；PCR 鑒定為陽性的菌落擴(kuò)繁提取質(zhì)粒，并做雙酶切鑒定（圖4），成功構(gòu)建細(xì)胞融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFPTkSRPP2。

圖3 TkSRPP2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖4 pCAMBIA2300-35S-GFP-TkSRPP2 雙酶切鑒定圖

圖5 TkSRPP2 亞細(xì)胞定位圖

2.4 TkSRPP2蛋白亞細(xì)胞定位

在模式植物煙草體內(nèi)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，用酶解法處理侵染后的葉片，成功制備原生質(zhì)體后，在激光掃描共焦顯微鏡下觀察，分析橡膠草TkSRPP2 蛋白的亞細(xì)胞定位情況（圖5）。顯微鏡下多數(shù)細(xì)胞中均有熒光，橡膠草TkSRPP2 蛋白定位于植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與其功能及預(yù)測結(jié)果相符。

2.5 TkSRPP2基因的時(shí)空表達(dá)特異性分析

采用qRT-PCR 分析橡膠草TkSRPP2基因的時(shí)空表達(dá)特異性，檢測TkSRPP2基因在6 月齡橡膠草根、葉、花、花葶等不同組織表達(dá)情況以及在1 月齡、3 月齡、5 月齡、6 月齡、7 月齡、8 月齡不同生長期橡膠草根部的表達(dá)量。結(jié)果（圖6）表明，TkSRPP2基因在6 月齡橡膠草根部表達(dá)量最高；6月齡橡膠草根部TkSRPP2基因表達(dá)量到達(dá)峰值。

3 討論

天然橡膠是一類有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的聚異戊二烯鏈，存在于約2500 種植物的膠乳細(xì)胞中。雖然不同物種膠乳中的化學(xué)成分存在一定差異，但天然橡膠生物合成的機(jī)制相似，植物體內(nèi)主要通過MVA 的類異戊二烯代謝途徑完成天然橡膠的合成，都涉及酶與膠乳中橡膠粒子結(jié)合的過程［12-13］。橡膠粒子中含有300 種以上蛋白質(zhì)，其中橡膠延伸因子（REF）和小橡膠粒子蛋白（SRPP）含量最高［14］。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，REF 蛋白和SRPP 蛋白為同源蛋白，都屬于植物應(yīng)激相關(guān)蛋白超家族［4］，在橡膠樹乳管細(xì)胞中，REF和SRPP家族基因均有很高的表達(dá)量［9］。在銀膠菊、橡膠草等產(chǎn)膠植物的乳膠中均發(fā)現(xiàn)了SRPP 蛋白，短角蒲公英的SRPP 蛋白與橡膠草中的極為相似，與橡膠粒子密切相關(guān)［15-16］。由此可見，這些基因與橡膠的生物合成相關(guān)。SRPP 蛋白屬于植物抗逆蛋白家族中的一員，已有研究表明，在環(huán)割脅迫后，SRPP 蛋白出現(xiàn)高表達(dá)和大量累積［17］；研究者在巴西橡膠樹SRPP基因啟動子的研究中發(fā)現(xiàn)，SRPP基因啟動子存在熱響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件等順式作用元件，據(jù)此推測SRPP基因在抵御逆境脅迫的生理過程中可能具有重要的功能［18］。

本研究從橡膠草植株中克隆得到全長633 bp 的編碼序列，并將其命名為TkSRPP2。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果顯示，該基因主要在橡膠草根中表達(dá)，與其協(xié)助橡膠草產(chǎn)膠的功能一致；6 月齡橡膠草根部TkSRPP2基因表達(dá)量達(dá)到峰值，此時(shí)橡膠草乳管分化最為完全。由此可見，TkSRPP2基因功能與乳管分化息息相關(guān)。運(yùn)用NCBI 中的Blastp 功能進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TkSRPP2 蛋白有一個(gè)REF 保守結(jié)構(gòu)域，符合SRPP 家族的基本特征。通過相關(guān)軟件預(yù)測TkSRPP2 蛋白結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，結(jié)果表明，該蛋白屬于堿性、親水性、不穩(wěn)定蛋白，沒有信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明TkSRPP2 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中，這一預(yù)測結(jié)果與煙草亞細(xì)胞定位結(jié)果相符。已有研究表明，SRPP 蛋白可能會通過滲透作用從橡膠粒子中釋放，在橡膠粒子膜脂質(zhì)的頭部基團(tuán)起到類似于“覆蓋”的作用［19］，本研究的預(yù)測結(jié)果符合這一特征。在橡膠樹中，SRPP 蛋白被認(rèn)為存在于橡膠粒子膜上，起到維持膠體穩(wěn)定性的作用，在調(diào)控膠乳形成過程中起著重要作用［20］。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，產(chǎn)膠植物的REF/SRPP 家族成員分布于一大支，其中橡膠草TkSRPP2 蛋白與萵苣SRPP3 蛋白有最近的親緣關(guān)系，橡膠樹SRPP 家族成員分布于另一小支，這也表明橡膠草TkSRPP2 蛋白與橡膠樹SRPP 蛋白具有相似功能。這些研究為TkSRPP2基因功能的探索提供了重要依據(jù)。

圖6 TkSRPP2 基因時(shí)空表達(dá)分析

4 結(jié)論

以橡膠草cDNA 為模板，克隆得到TkSRPP2基因。該基因主要在根部表達(dá)，在6 月齡橡膠草根部表達(dá)量達(dá)到峰值，TkSRPP2 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。