魯琳 趙希勝 劉桂雲(yún) 劉維東 王艷婷 吳玲莉 任學良

魯黎明2

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130；3. 貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081）

轉錄因子是一類能夠調控下游基因轉錄的關鍵DNA 結合蛋白，它能夠特異地結合在真核生物基因的啟動子順式作用元件區(qū)域，從而激活或者抑制基因的表達［1］。高等植物中，有眾多的轉錄因子，其中，AP2/ERF 類轉錄因子較為古老，為植物所特有且植物中最大的一類，。從結構上看，AP2/ERF 類轉錄因子均含有1-2 個高度保守的AP2 結構域，含有1 個結構域的為ERF 亞家族，含有2 個結構域的為AP2亞家族［2］。

AP2/ERF 家族轉錄因子在植物的生命活動過程中發(fā)揮著十分重要的作用，參與了細胞增殖、花器管發(fā)育、植物次生代謝、植物激素應答等重要過程［3-6］。同時，越來越多的研究證明，AP2/ERF 類轉錄因子還參與了干旱、高滲、低溫、高鹽等非生物脅迫和抵御微生物侵染等生物脅迫響應［3-4，7-13］。正因為該類轉錄因子的多重功能，所以其在植物中的數(shù)量巨大。隨著植物基因組測序工作的不斷推進，以及生物信息學技術的不斷進步與完善，極大地促進了AP2/ERF 轉錄因子超級家族的研究工作。目前，模式植物擬南芥、水稻中，分別鑒定出了122、139個AP2/ERF 轉錄因子［1］；在玉米中有167 個AP2/ERF 轉錄因子［14］；在辣椒中發(fā)現(xiàn)了123 個成員［15］；在葡萄、番茄、馬鈴薯中分別鑒定出了149、167、246 個 AP2/ERF 類轉錄因子［16］。

花煙草是屬于茄科煙草屬的一年生草本觀賞花卉，其花色種類繁多、花期較長，是優(yōu)美的花壇、花鏡材料，是我國許多城市的重要的綠化美化材料。研究其ERF 轉錄因子的定位、表達模式及功能等，對于探索花煙草的生長發(fā)育的機制具有重要意義。因此，本研究利用同源克隆的方法，克隆了一個花煙草的ERF基因，采用生物信息方法對該基因進行了鑒定，并分析了其組織表達及響應非生物脅迫的表達模式，以期為花煙草ERF 基因的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以花煙草（Nicotiana alata）為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 植物材料的培養(yǎng)及非生物脅迫處理 材料培養(yǎng)：挑選籽粒飽滿且大小一致的種子，用次氯酸鈉溶液表面消毒后，用無菌水清洗數(shù)次，隨后播種于MS 培養(yǎng)基上，并置于恒溫培養(yǎng)室中生長（光照：16 h 光/8 h 暗；溫度：25℃）。

非生物脅迫處理及取材：種子萌發(fā)后，在MS培養(yǎng)基上生長至2 片真葉時，取10 株幼苗，在液氮中速凍，用于目的基因的克隆。同時，挑選長勢一致的煙苗，分別進行低溫（4℃）、干旱（5%PEG6000）、高鹽（200 mmol/L）、低鉀（10 μmol/L）、ABA（1 μmol/L）及H2O2（10 mmol/L）處理。進行低溫處理時，將煙苗置于4℃光照培養(yǎng)箱中；進行其它非生物脅迫處理時，將煙苗分別移至含有5%PEG6000、200 mmol/L Nacl、10 μmol/L 鉀、1 μmol/L ABA 及10 mmol/L H2O2的MS 培養(yǎng)基上，然后置于25℃光照培養(yǎng)箱中。每個處理設3 個重復，每重復15 株煙苗。在處理后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h 后，分處理、重復進行整株取樣，并置于液氮中保存，用于總RNA 的提取。

低鉀MS 培養(yǎng)基（鉀離子終濃度為10 μmol/L）的配制，參照張雪微等方法進行［17］。

此外，采用上述種子處理方法，將種子消毒后，播種于塑料盆中進行培養(yǎng)。待煙苗發(fā)育到4葉1心時，分別取煙苗的根、莖、葉及開花期的煙花，保存于液氮中，用于目的基因的組織表達分析。

1.2.2 目的基因克隆 總RNA 的提取及反轉錄：采用Trizol 法提取煙苗的總RNA［18］，然后，參照cDNA 合成試劑盒的方法，進行反轉錄及cDNA 合成。

目的基因的克?。簠⒄罩参锏腅RF基因序列，利用Primer Premier 5 軟件設計兼并PCR 引物。在預試驗的基礎上，設計特異引物進行PCR 擴 增。 引 物 序 列 如 下：ERF1-F：5′-GCCC ATGGAACAAGAACAAGTATATGA-3′，ERF1-R ：5′-GCCCTAACTAGGACAAAACATTTG-3′。以合成的cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應程序為：98℃ 5 min；94℃ 30 s；53℃ 30 s；72℃ 1 min；35 個循環(huán)；72℃ 10 min；12℃終止。PCR 反應體系為（25 μL）：cDNA 模 板1 μL，Taq Buffer（10x）5 μL，2.5 mol/L dNTP 2 μL，正反引物各1 μL，Taq 酶 1μL，ddH2O 14 μL。PCR 反應結束后，將產(chǎn)物進行凝膠電泳，回收并純化目的片段，連接pEASY-Blunt Simple 克隆載體，轉化Trans1-T1 感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素抗性平板上篩選，挑取陽性單克隆進行菌液PCR驗證后，送至上海生工生物工程技術有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用DNAMAN 8 軟件對測序正確的序列進行分析，并翻譯成氨基酸序列。用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/） 對 其基本理化性質進行分析，用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預測蛋白親/疏水性。用CDD（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測蛋白結構域。用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進行亞細胞定位分析，用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測磷酸化位點，用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）和Phyre2 分別進行目的蛋白的二級結構和三級結構預測；利用MEGA7 軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 目的基因的組織表達及響應非生物脅迫的誘導表達分析 引物設計：采用Primer Premier 5軟件，進行引物設計，用于目的基因的組織表達及響應非生物脅迫的誘導表達分析。正向引物：ERF1-qF：5′-GCCTCTGAACCTATTGCC-3′，反 向 引物：ERF1-qR：5′-TGCCACGATAAAGGACTG-3′；內 參 為18S rRNA， 引 物 序 列 為18S-F：5′-CCTACGCTCTGTATACATTAGC-3′ ；18S-R ：5′-GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC-3′。

目的基因的組織表達及受誘導表達分析：按上述方法提取樣品的總RNA，并進行反轉錄合成cDNA。以花煙草18S rRNA 為內參，以cDNA 為模板，采用qRT-PCR 的方法，進行目的基因片段的PCR擴增。目的基因相對表達量的計算，采用2-△△Ct的方法進行，并利用EXCEL 軟件進行統(tǒng)計分析及做圖。

“很多問題要等監(jiān)管層的明確批示?！鄙鲜鲢y行資管部門經(jīng)理告訴《中國經(jīng)濟周刊》記者，目前有很多細節(jié)還沒有確認，尤其是涉及到存量產(chǎn)品和存量業(yè)務轉移的具體事宜。此外，缺人也成為眼下成立理財子公司的銀行面臨的主要問題?！扒也徽撔庐a(chǎn)品的開發(fā)和新業(yè)務的展開，僅是目前的存量業(yè)務，原有負責人員肯定不可能全部轉去理財子公司。現(xiàn)在在市場上，權益投資、固收投資等方面的人才，幾家銀行全都在抓緊招聘?！?/p>

2 結果

2.1 目的基因的克隆

以煙草幼苗為材料提取總RNA，反轉錄后進行PCR 擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，在750 bp-1000 bp 之間有一條清晰明亮的條帶（圖1）。條帶經(jīng)回收純化后送樣測序。將測序結果用DNAMAN8 進行分析并翻譯成蛋白序列。同時，在NCBI 網(wǎng)站上分析其ORF 序列。結果顯示，該基因ORF 長度為819 bp，編碼272 個氨基酸。

在NCBI 上，用BLAST 對目的基因的CDS 序列進行比對，結果表明該基因對多個物種的ERF基因同源性較高。于是，將目的基因命名為NaERF1。

圖1 NaERF1 基因克隆

2.2 NaERF1蛋白的生物信息學分析

2.2.1 理化性質分析 利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對NaERF1 蛋白的理化性質進行了分析，結果顯示，NaERF1 編碼272 個氨基酸，該蛋白的分子式為C1339H2064N376O431S13；分子量為30742.16 Da；理論pI 值：6.07；脂肪系數(shù)為57.72，帶負電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)為31 個，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為27 個。NaERF1 蛋白的平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.659，在該蛋白氨基酸組成中絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）含量較高，分別占氨基酸總數(shù)的10.7%和9.2%；半胱甘酸（Cys）和色氨酸（Trp）含量較低，分別占氨基酸總數(shù)的1.5%和1.8%。

2.2.2 親/ 疏水性分析 利用ExPaSy 網(wǎng)站的ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）， 選 擇Hphob./Kyte&Doolittle 算法，對NaERF1 蛋白的親/疏水性進行了分析，結果如圖2 所示。NaERF1 蛋白序列中第13 位氨基酸最高分值為1.144，第266 位氨基酸最低分為-2.322。總體上看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，且平均分值大于疏水性氨基酸，可推測NaERF1 蛋白屬于親水性蛋白。

圖2 NaERF1 蛋白親/疏水性分析

2.2.3 跨膜結構預測 采用ExPASy 提供的TMHMM Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）軟件，在線對NaERF 的跨膜區(qū)進行預測，結果如圖3 所示。預測結果表明，NaERF1 蛋白沒有跨膜區(qū)，不屬于跨膜蛋白。

圖3 NaERF1 蛋白跨膜區(qū)分析

2.2.4 亞細胞定位 利用在線軟件Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/），選用Plant-mPLoc，對NaERF1 蛋白進行了亞細胞定位分析。結果顯示，該蛋白位于細胞質的可能性為41.5%，位于過氧化物酶體（Peroxisome）的可能性為28%，位于線粒體基質（Mitochondrial matrix space）的可能性為10%。因此，推測該蛋白可能定位于細胞質中。

圖4 NaERF1 蛋白磷酸化位點預測

2.2.6 功能域與信號肽預測 通過CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 網(wǎng) 站，對NaERF1 蛋白進行了保守功能域預測。結果（圖5）顯示，NaERF1 蛋白的第22-83 位氨基酸，存在一個典型的ERF 轉錄因子保守結構域（AP2）。表明NaERF1 蛋白屬于植物的AP2/ERF 家族，推測能夠行使植物AP2/ERF 基因的功能。

通 過SignalP 4.1（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件，對NaERF1 蛋白信號肽進行預測，結果（圖6）顯示，該蛋白不含有信號肽。

2.2.7 二級結構預測與三級結構預測 利用SOPMA在線軟件，對NaERF1 蛋白的二級結構進行了預測，結果如圖7 所示。NaERF1 蛋白主要由51.10%的無規(guī)卷曲（random coil，139 個氨基酸參與），38.97%的α-螺旋（alpha helix，106 個氨基酸參與），7.72%的延伸鏈（extended strand，21 個氨基酸參與），2.21%β-轉角（beta turn，6 個氨基酸參與）所構成。同時，利用Phyre2 軟件預測了NaERF1 蛋白的三級結構。

2.2.8 NaERF1 編碼蛋白的同源性分析 利用NCBI Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 在 線工具，在數(shù)據(jù)庫中，搜索并選取與NaERF1序列相似度大于70%以上的37 個同源基因，采用MEGA7軟件，選用鄰位相連法、Bootstrap method 選擇1000進行計算，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）。從分析的結果可以看出，NaERF1與茄科植物的ERF基因親緣關系較近，而與其它植物的ERF基因親緣關系較遠。其中，同源性最高的為普通煙草（Nicotiana tabacum）的ERF基因（XP 016476774.1），同源性最低的為橡膠樹的ERF基因（XP 021640270.1）。

圖5 NaERF1 蛋白功能域的預測

圖6 NaERF1 蛋白的信號肽預測

圖7 NaERF1 蛋白的二級結構與三級結構預測

2.3 NaERF1的組織表達分析

采用qRT-PCR 的方法，對NaERF1在花煙草不同組織與器官中的表達量進行了分析。結果（圖9）顯示，NaERF1基因的表達具有組織特異性，其在花中表達量最高，莖中次之，根和葉中表達量較低。該結果說明，NaERF1廣泛參與了花煙草的生理生化過程，并有可能主要在花中發(fā)揮作用。

2.4 NaERF1響應非生物脅迫的表達模式

為了探究NaERF1在花煙草適應非生物逆境中的作用，分析了NaERF1在PEG、高鹽、低鉀、低溫、ABA 和H2O2處理下，0 h、3 h、6 h、12 h 及24 h 的表達情況。結果（圖10）顯示，NaERF1基因的表達對這6 種非生物脅迫均有所響應。但其響應表達的模式，有明顯不同。例如，隨著脅迫時間的推移，對低溫的響應呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢（圖10-A）；對低鉀及ABA 呈現(xiàn)先升高后降低的模式（圖10-B-C）；對PEG 脅迫表現(xiàn)為先升高再降低再升高（圖10-D）；對H2O2的表現(xiàn)為先降低再升高又降低（圖10-E）；而對高鹽脅迫，NaERF1的表達則表現(xiàn)為持續(xù)降低（圖10-F）。本結果表明，NaERF1可能參與了花煙草對干旱、低溫等非生物脅迫的響應過程。

3 討論

植物ERF家族基因，不但數(shù)量眾多，而且所行使的功能也較為復雜，例如參與植物的生長發(fā)育以及生物與非生物脅迫的應答反應等［2-4，16，19-20］。其功能的行使，依靠其保守的AP2/ERF 結構域，該結構域由大約60 個氨基酸所組成［16］。本研究所克隆的NaERF1基因所編碼的蛋白，也包含了一個AP2/ERF 結構域。所以，可以推測，NaERF1隸屬于花煙草的ERF 家族，能夠行使植物ERF家族基因所具有的功能。

在擬南芥［1］、水稻［1］、玉米［14，21］、辣椒［15］及普通煙草［20］上的研究表明，植物的ERF基因，不但成員眾多，而且其亞細胞定位較為復雜，可以在細胞質、細胞核、葉綠體以及線粒體中特異表達。本研究對NaERF1進行的亞細胞定位的預測結果表明，該基因主要定位于細胞質，與前人的研究結果相一致。此外，NaERF1基因具有組織表達特異性，在花中的表達量最高，在莖、根和葉片中也均有表達。該結果與普通煙草ERF的組織表達模式較為一致［20］。這些結果暗示，NaERF1可能廣泛參與了花煙草的生長發(fā)育及其生理進程。

圖8 NaERF1 蛋白的同源性分析

圖9 NaERF1 在花煙草不同組織器官中的表達分析

研究表明，植物的ERF基因廣泛參與了植物響應非生物脅迫的響應過程［16，20］。例如，擬南芥的ERF基因，參與了干旱及冷害的脅迫響應［2］。過量表達TERF2 能夠提高轉基因煙草及番茄植株對低溫脅迫的耐受性［22］。對水稻而言，過量表達OsAP37［23］、OsERF48［24］及OsERF71［25-26］，均能夠增強轉基因植物的耐旱性；而SERF1則參與了水稻耐鹽性的調控，當其功能缺失時，水稻植株對鹽脅迫更敏感［27］。番茄的TERF2在水稻中過表達，使得轉基因水稻的耐冷性得到了提高［28］。此外，羊草LcDREB3a在擬南芥中的過量表達，可提高轉基因植物的抗旱和抗鹽能力［29］。本研究分析了NaERF1在PEG、高鹽、低鉀、低溫、ABA 和H2O2處理下的表達情況。結果顯示，NtaERF1基因的表達，受低鉀、ABA 的強烈誘導；同時，也在轉錄水平上對PEG、高鹽、低溫及H2O2的脅迫有較為明顯的響應。具體而言，其響應模式可以分為：（1）先降低后升高型，如在低溫脅迫下的表達；（2）先升高后降低型，如在低鉀及ABA 脅迫下的表達；（3）先升高再降低再升高型，如響應PEG 脅迫的表達；（4）先降低再升高又降低型，如響應H2O2的誘導表達；（5）持續(xù)降低型，如在高NaCl 脅迫下的表達。本研究結果說明，與植物的其它AP2/ERF 家族轉錄因子相類似，NaERF1也可能廣泛參與了非生物逆境脅迫的生理響應。其中的調控機制，尚有待于進一步的探索。

圖10 NaERF1 在非生物脅迫下的表達模式

4 結論

花煙草NaERF1基因所編碼的蛋白具有典型的AP2 家族保守結構域，屬于植物的ERF 家族。該基因的表達具有組織特異性，并且響應非生物脅迫的誘導，能夠在花煙草非生物脅迫響應中行使相應的功能。