宮 宇，卞艷芳，周春娜，許 琛

(海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院/上海長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

青黛為爵床科植物馬藍(lán)[Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek.]、蓼科植物蓼藍(lán)(PolygonumtinctoriumAit.)或十字花科植物松藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的葉或莖葉加工制得的干燥粉末、團(tuán)塊或顆粒，具有清熱解毒、涼血消斑和瀉火定驚的作用，臨床主要用于口舌生瘡、口腔潰瘍及由于溫?zé)嵋鸬纳匣鸢Y狀[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，青黛的主要活性成分為靛藍(lán)和靛玉紅[4-6]。靛藍(lán)主要用于紡織品的染料，同時(shí)也可以用于食品、醫(yī)藥和化妝品的著色；靛玉紅具有涼血解毒、抗炎及抗腫瘤的作用，臨床用于治療慢性粒細(xì)胞白血病等[7]。目前對(duì)青黛的研究主要有化學(xué)成分[8]、微量元素[9]、指紋圖譜[10-11]、抗真菌成分[12]和染色研究[13-14]等，由于青黛制備工藝復(fù)雜且產(chǎn)量低，近年來(lái)有報(bào)道不少不良商家為了提高青黛藥材的外觀色澤，在青黛中添加一些人工合成色素，有孔雀石綠、結(jié)晶紫和亮藍(lán)[15]等。亮藍(lán)是一種非偶氮類的水溶性著色劑，具有成品低廉、色澤亮麗和著色力強(qiáng)的特點(diǎn)，主要用于食品中飲料、糖果和糕點(diǎn)上的彩妝，《食用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760-1996對(duì)其使用進(jìn)行了限量規(guī)定[16]。由于亮藍(lán)是由煤焦油中的苯胺為原料經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的工藝合成而來(lái)，因此具有一定的毒性。本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，采用薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)和超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-fast liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometer，UFLC-MS/MS)法進(jìn)行鑒別與定量。對(duì)10批不同來(lái)源的青黛進(jìn)行了染色鑒別，并對(duì)鑒別出的亮藍(lán)進(jìn)行了含量測(cè)定研究，為青黛藥材中的非法染色鑒別提供依據(jù)，從而保證臨床用藥安全。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu UFLC-8040型超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津儀器公司)，包括二元高壓洗脫泵，UV檢測(cè)器；Labsolution工作站，BSA-124S型電子天平(德國(guó)賽多利斯)，TLC硅膠G薄層色譜板(美國(guó)Merck公司)。

1.2 藥品與試劑

青黛藥材分別來(lái)源于福建、云南和江蘇等地區(qū)，所有藥材購(gòu)自上海凱旋門中藥材市場(chǎng)和上海長(zhǎng)海醫(yī)院中藥房，所有藥材均經(jīng)卞艷芳主管藥師鑒定為爵床科植物馬藍(lán)的葉或莖葉加工制得的干燥粉末，有2批樣品疑似染色。對(duì)照品：亮藍(lán)(批號(hào)：GBW10004，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.3%)購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；亮藍(lán)G、酸性綠50、亞甲基藍(lán)和甲基藍(lán)均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；水為超純水(美國(guó)Milli-Q公司)；甲酸為色譜純；乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、正丁醇、氫氧化銨及乙醇等均為分析純(上海國(guó)藥試劑化學(xué)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

取上述取10個(gè)不同批號(hào)產(chǎn)地的青黛藥材粉末，稱取0.5 g，加乙醇25 ml，超聲處理10 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別精密稱取亮藍(lán)、亮藍(lán)G、酸性綠50、亞甲基藍(lán)和甲基藍(lán)對(duì)照品適量，加甲醇稀釋制成每1 ml分別含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取上述供試品和對(duì)照品溶液各2 μl，按照TLC法(通則0502)試驗(yàn)，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水(V∶V∶V∶V∶V=1∶3∶3∶1∶1)為展開劑，展開8 cm，取出，晾干，在日光下檢視。供試品色譜中，只有3號(hào)和8號(hào)供試品疑似在與亮藍(lán)對(duì)照品位置上有相同顏色的斑點(diǎn)，其他供試品未有與上述對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，見圖1。

2.2 液相色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：UFLC-8040超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津儀器公司)，Shim-packVP-ODS色譜柱(2.1 mm×100 mm，2 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.01%甲酸水(V∶V=36∶64)，流速0.4 ml/min；柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積1 μl。質(zhì)譜條件為電噴霧ESI離子源，正離子掃描，干燥氣和霧化器為液氮，加熱器為空氣，霧化器流量3 L/min，干燥器流量10 L/min，加熱器流量10 L/min，接口溫度300 ℃，脫溶劑管溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～1 000；駐留時(shí)間100 msec，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，亮藍(lán)在MRM檢測(cè)模式下，質(zhì)譜參數(shù)為：一級(jí)離子(m/z)793.2，二級(jí)離子(m/z)為623.1 CE能量為-45.0 eV，713.1 CE能量為-39.0 eV，543.3 CE能量為-50.0 eV，m/z 623.1為定量離子，一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取亮藍(lán)對(duì)照品5.16 mg置于25 ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取上述亮藍(lán)對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml置于50 ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(每1 ml含亮藍(lán)4.128 μg)。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取上述3號(hào)染色的青黛藥材粉末0.5 g，加甲醇25 ml，超聲處理10 min，靜置，放涼，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

取“2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液作為對(duì)照品5號(hào)溶液，然后精密吸取5號(hào)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液3 ml置于10 ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，作為4號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取4號(hào)對(duì)照品溶液3 ml置于10 ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，作為3號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取3號(hào)對(duì)照品溶液3 ml置于10 ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，作為2號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取2號(hào)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液3 ml置于10 ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，作為1號(hào)對(duì)照品溶液。精密吸取上述1—5號(hào)對(duì)照品溶液各1 μl，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量的質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X，ng)，相對(duì)應(yīng)的的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果亮藍(lán)對(duì)照品的質(zhì)量在16.27～2 008.27 ng范圍內(nèi)線性方程為Y=4.590 1X-25.823，相關(guān)系數(shù)r=1.000 0。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下的1、3和5號(hào)對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣1 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，亮藍(lán)峰面積的RSD為0.38%，表明該儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取3號(hào)染色青黛藥材，按照“2.4”項(xiàng)下供試品溶液制備，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、1、2、4、8、12及24 h進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為1 μl，連續(xù)考察24 h，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，亮藍(lán)峰面積的RSD為2.06%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取3號(hào)染色青黛藥材，按照“2.4”項(xiàng)下的供試品制備方法，平行制備6份供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，6份供試品中亮藍(lán)含量值的RSD為1.53%，表明該方法的重復(fù)性良好。

A.亮藍(lán)對(duì)照品的總離子流圖；B.亮藍(lán)對(duì)照品的一級(jí)質(zhì)譜圖；C.亮藍(lán)對(duì)照品的二級(jí)碎片質(zhì)譜圖；D.青黛樣品中亮藍(lán)的總離子流圖；E.青黛樣品中亮藍(lán)的一級(jí)質(zhì)譜圖；F.青黛樣品中亮藍(lán)的二級(jí)碎片質(zhì)譜圖A. total ion current chromatogram of reference indigo naturalis; B. primary mass spectra of reference indigo naturalis; C. secondary fragment mass spectra of reference indigo naturalis; D. total ion current chromatogram of brilliant blue in indigo naturalis sample; E. primary mass spectra of brilliant blue in indigo naturalis sample; F. secondary fragment mass spectra of brilliant blue in indigo naturalis sample圖2 青黛中亮藍(lán)的質(zhì)譜圖Fig 2 Mass spectra chromatogram of brilliant blue in indigo naturali

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取3號(hào)染色青黛藥材0.25 g，共9份，每3份為1組，取“2.3”項(xiàng)下亮藍(lán)對(duì)照品溶液1 ml置于25 ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，作為待加溶液，分別采用低、中及高三種不同濃度進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，然后分別向上述每組樣品中，精密加入上述待加溶液1、2及3 ml，然后按照“2.4”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備和“2.2”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算亮藍(lán)的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

表1 亮藍(lán)的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 1 Results of standard addition recovery of brilliant blue (n=9)

2.10 亮藍(lán)的含量測(cè)定

取上述3號(hào)和8號(hào)兩個(gè)不同產(chǎn)地的染色青黛藥材，按照“2.4”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用標(biāo)曲法分別計(jì)算兩批染色青黛藥材中亮藍(lán)的含量。結(jié)果顯示，3號(hào)和8號(hào)樣品中亮藍(lán)的含量分別為1.230 6和2.012 8 mg/kg。

3 討論

3.1 非法染色的鑒別

本研究首先將10批青黛藥材進(jìn)行提取處理，采用常用的青黛染色劑亮藍(lán)、亮藍(lán)G、酸性綠50、亞甲基藍(lán)和甲基藍(lán)等5種對(duì)照品，按照《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2015年版)色素指導(dǎo)原則進(jìn)行TLC鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2批樣品在與亮藍(lán)對(duì)照品TLC相同的位置上具有相同的顏色的斑點(diǎn)，因此判斷這2批藥材可能進(jìn)行了亮藍(lán)染色；然后，采用UFLC-MS/MS對(duì)其進(jìn)行鑒別和確認(rèn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品在與亮藍(lán)對(duì)照品的TIC圖在相同的保留時(shí)間出現(xiàn)相同的色譜峰，且一級(jí)質(zhì)譜圖顯示亮藍(lán)的母離子m/z為793.2 [M+H]峰，二級(jí)質(zhì)譜圖的碎片離子分別m/z 為713.1、623.1和543.3等3個(gè)碎片離子，且3號(hào)和8號(hào)2批樣品的質(zhì)譜一級(jí)和質(zhì)譜二級(jí)碎片圖與亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品一致，因此更加確定上述2批青黛藥材進(jìn)行了亮藍(lán)的染色。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究首先采用正負(fù)離子掃描亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正離子下質(zhì)譜響應(yīng)比負(fù)離子下高2個(gè)數(shù)量級(jí)，母離子為 [M+H]峰為793.2，選擇強(qiáng)度最高的二級(jí)特征離子[M-SO3]+(m/z 713.1)峰面積進(jìn)行定量，采用MRM模式，進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時(shí)分別采用采用乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液及甲醇-0.1%甲酸水溶液等流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%水溶液出峰時(shí)間太長(zhǎng)，峰形偏寬；乙腈-水溶液色譜峰有點(diǎn)拖尾；乙腈-0.1%甲酸水溶液色譜峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)。故本研究最終確定乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，對(duì)亮藍(lán)進(jìn)行了檢測(cè)。

3.3 結(jié)果分析

從本研究所建立的方法來(lái)看，10批不同產(chǎn)地的青黛藥材中就有2批藥材進(jìn)行了亮藍(lán)染色，因此對(duì)青黛藥材中的非法染色進(jìn)行研究是有必要的。目前，青黛藥材的國(guó)家藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)批件中有非法染色孔雀石綠的檢查項(xiàng)，未有亮藍(lán)的染色檢查項(xiàng)目。參考食品添加劑中對(duì)亮藍(lán)的限量標(biāo)準(zhǔn)，最高標(biāo)準(zhǔn)為冰淇淋中的使用量不得超過(guò)0.022 g/kg，判斷上述2批青黛中雖有添加亮藍(lán)，但未超標(biāo)。但由于藥品中不允許檢出亮藍(lán)，故應(yīng)引起檢驗(yàn)監(jiān)管部門的注意，同時(shí)建議將亮藍(lán)的染色鑒別增加到青黛藥材檢驗(yàn)批件標(biāo)準(zhǔn)中。本研究所建立的亮藍(lán)的UFLC-MSMS法通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，可以為青黛藥材中亮藍(lán)的染色鑒別和含量測(cè)定提供參考。