顏 亮， 曹 隴， 張名康， 陸鑫宇， 李雨朦， 馬金珠， 徐 蕾， 范 倩

(1皖南醫(yī)學(xué)院活性生物大分子安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 蕪湖241002; 2天津市腫瘤醫(yī)院， 天津300060)

據(jù)最新的全球腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肺癌位于全球腫瘤發(fā)病率及致死率第1位，已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，肺癌的早期診斷及治療方式有了明顯的進(jìn)步，但由于肺癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，肺癌患者的5年存活率還是很低[2]。因此，對(duì)肺癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)并合成新的肺癌治療的有效藥物對(duì)肺癌的有效治療至關(guān)重要。

近年來(lái)，氧化吲哚螺環(huán)類衍生物已被證明具有良好的抗病毒[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]及抗結(jié)核[6]等藥理活性。由于氧化吲哚螺環(huán)具有很好的靶向性以及藥理活性，據(jù)報(bào)道有多種以氧化吲哚螺環(huán)為基本骨架的靶向先導(dǎo)藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[7-8]。而在肺癌中，有關(guān)氧化吲哚螺環(huán)類衍生物的生物學(xué)活性及抗腫瘤活性的研究還很少?；谘趸胚崧莪h(huán)類衍生物在抗腫瘤藥物研發(fā)中的重要作用，本研究觀察了氧化吲哚螺環(huán)新的衍生物二吲哚吡啶基噻唑烷(di-indolyl thiozoline， DIIT)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，初步探索了DIIT在肺癌中的潛在抗腫瘤活性。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。DIIT為南京大學(xué)化工學(xué)院合成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1A所示；胎牛血清購(gòu)自Gibco；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)試劑有限公司；EdU試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；DAPI購(gòu)于北京凱基生物科技有限公司；抗p-Akt、p-mTOR、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)及GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Techology；Ⅱ抗購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549在37℃、5% CO2的環(huán)境下，用濃度為10%胎牛血清和抗生素(1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 按照密度為每孔1×104將人肺癌細(xì)胞A549接種到96孔板中。加入濃度為(12.5、25、50和100 mg/L)的DIIT處理細(xì)胞24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑(2.5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞相對(duì)活力=實(shí)驗(yàn)組A450值/空白對(duì)照組A450值。

2.3EdU/DAPI雙染法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 細(xì)胞處理方法同2.2，將處理后的細(xì)胞按照每孔1×104的密度接種到48孔板，每孔加入150 μL濃度為50 μmol/L的EdU培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h；PBS清洗細(xì)胞3次，每次5 min；在每孔加入200 μL濃度為4%多聚甲醛，固定40 min；每孔加入200 μL濃度為2 g/L甘氨酸，孵育5 min；棄去溶液，PBS清洗細(xì)胞3次,每次5 min；每孔加入200 μL含0.5% Triton X-100 的PBS清洗1次；每孔加入200 μL Apollo染色液，暗室孵育30 min，再每孔加入濃度為1 mg/L的DAPI暗室染色20 min，通過熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞處理方法同2.2，將各組細(xì)胞裂解物收集。4 ℃、12 000 ×g離心5 min，吸取上清液。BCA法測(cè)定每組蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，100 ℃ 5 min，冷卻后，根據(jù)每組蛋白濃度，按照每孔60 μg進(jìn)行上樣。經(jīng)SDS-PAGE(10%)后，把蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用TBST配制的5% 脫脂奶封閉PVDF膜，室溫1 h。然后加入稀釋的 I 抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST清洗6次，每次5 min。加入稀釋好的 II 抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，TBST清洗6次，每次5 min。清洗好的膜放入暗盒上，正面朝上，加入發(fā)光底物，暗室曝光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DIIT抑制A549細(xì)胞的活力

使用濃度為12.5、25、50和100 mg/L的DIIT孵育A549細(xì)胞24 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與DMSO對(duì)照組相比，25、50和100 mg/L的DITT處理后細(xì)胞相對(duì)活力均顯著下降(P<0.01)。運(yùn)用GraphPad軟件(V5.0)計(jì)算了該化合物的IC50值為91.02 mg/L,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DIIT可以劑量依賴性抑制A549細(xì)胞活力，見圖1B。為了檢測(cè)DIIT對(duì)A549 細(xì)胞形態(tài)的影響，通過倒置顯微鏡下觀察并收集了細(xì)胞圖像，結(jié)果顯示，與DMSO對(duì)照組相比，隨著DIIT濃度的增加，細(xì)胞體積縮小、連接疏散，細(xì)胞間隙增大，與周圍細(xì)胞脫離，生長(zhǎng)狀態(tài)差，見圖2。以上結(jié)果表明DIIT顯著抑制了A549細(xì)胞的活力。

2 DIIT抑制A549細(xì)胞的增殖

使用EdU/DAPI雙染法檢測(cè)DIIT對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，EdU陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)數(shù)比DMSO對(duì)照組分別降低10%、21%(P<0.05)、26%(P<0.05)及34%(P<0.01)，見圖3,說明DIIT可以劑量依賴性抑制A549細(xì)胞增殖。

3 DIIT對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響

為了驗(yàn)證DIIT對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，使用12.5、25、50和100 mg/L DIIT處理A549細(xì)胞24 h，Western blot法檢測(cè)了細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白水平等變化。結(jié)果顯示，與DMSO對(duì)照組相比，DIIT可以抑制Akt及mTOR的磷酸化水平，抑制細(xì)胞周期蛋白CDK4及cyclin D1的表達(dá)水平(P<0.01),見圖4。

討 論

近年來(lái)，研究表明以氧化吲哚螺環(huán)為基本結(jié)構(gòu)的化合物在抗腫瘤的治療方面表現(xiàn)出良好的藥理活性，如彭禮軍等[9]合成了新型的芳姜黃酮拼合吡咯螺環(huán)氧化吲哚類化合物，并發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)白血病細(xì)胞具有一定的抑制活性；另有報(bào)道表明，新型烷氧基嘧啶拼接3-吡咯螺環(huán)氧化吲哚類化合物對(duì)肺癌、前列腺癌和白血病細(xì)胞具有抑制作用[10]，上述報(bào)道主要關(guān)注其合成過程及抗腫瘤活性，關(guān)于其抗腫瘤的具體機(jī)制研究還很少。本研究評(píng)估了DIIT對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明DIIT可以直接抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)，改變細(xì)胞形態(tài)并抑制細(xì)胞的增殖。

Figure 1.The structure of DIIT and its effect on the viability of A549 cells. A: the structure of DIIT; B: the effect of DIIT on the viability of A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsDMSO group.

圖1 DIIT的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)肺癌細(xì)胞A549活力的影響

Figure 2.The effect of DIIT on the morphology of A549 cells (×200).

圖2 DIIT對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 3.The effect of DIIT on the proliferation of A549 cells by EdU assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖3 DIIT對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

Figure 4.The effect of DIIT on the expression of cell proliferation signaling pathway-related proteins in A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖4 DIIT對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的影響

研究表明，在肺癌細(xì)胞的增殖過程中，PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用，該信號(hào)通路中的一些信號(hào)蛋白分子可以作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[11-13]。本研究檢測(cè)了經(jīng)DIIT處理后肺癌A549細(xì)胞的Akt及mTOR磷酸化水平，結(jié)果表明DIIT可以有效抑制Akt及mTOR的磷酸化，提示Akt及mTOR可能是DIIT抑制A549細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)。細(xì)胞周期調(diào)控發(fā)生異常也是肺癌發(fā)病的機(jī)制之一，cyclin D1在肺癌中常出現(xiàn)異常高表達(dá)[14-16],該蛋白是CDK4的調(diào)節(jié)亞基，其異常表達(dá)會(huì)影響CDK4的表達(dá)，最終引起細(xì)胞周期異常[17-18]。因此，本研究檢測(cè)了經(jīng)DIIT處理肺癌A549細(xì)胞后細(xì)胞周期蛋白CDK4及cyclin D1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)DIIT可以有效抑制CDK4及cyclin D1的表達(dá)水平，提示DIIT可能通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌A549細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究在體外證實(shí)了DIIT具有抑制肺癌A549細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制可能與抑制AKT及mTOR的磷酸化水平，并抑制細(xì)胞周期蛋白CDK4及cyclin D1的表達(dá)水平有關(guān)。但細(xì)胞形態(tài)學(xué)的結(jié)果表明，隨著DIIT濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變并發(fā)生了脫落，以上結(jié)果表明DIIT并不僅僅只抑制了肺癌A549細(xì)胞的增殖，后續(xù)研究需要關(guān)注其對(duì)A549細(xì)胞凋亡及其它功能的影響及其具體機(jī)制。上述研究結(jié)果為該類新合成的化合物具有的抗腫瘤潛在活性及其機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在后續(xù)的研究中我們要進(jìn)一步明確DIIT抑制肺癌A549細(xì)胞增殖的具體機(jī)制。