王 秋， 黃偉劍

(溫州醫(yī)科大學附屬樂清醫(yī)院， 浙江 溫州 325000)

動脈粥樣硬化是心肌梗死、中風、不穩(wěn)定心絞痛和心臟猝死的潛在原因[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)是動脈壁的主要成分之一，最近的研究證明VSMCs的異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中重要的病理生理基礎[2]。因此，抑制VSMCs增殖和遷移可能在預防動脈粥樣硬化的病理過程中起著重要作用，并可能成為一種新的治療策略。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。研究表明，lncRNA在動脈粥樣硬化中表達異常，在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中扮演著重要的角色[3]。ZNFX1 (zinc finger NFX1-type containing 1) antisense RNA 1 (ZFAS1)是位于染色體20q13的lncRNA，被報道作為腫瘤抑制基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。Zhang等[5]報道ZFAS1在小鼠心肌梗死模型中表達升高，導致心臟收縮功能障礙。但是，ZFAS1在動脈粥樣硬化中對血管平滑肌細胞的作用尚未見報道。本項工作探討ZFAS1對VSMCs增殖和遷移的影響，及其在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的可能作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

大鼠VSMCs購自ATCC。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液購自Gibco；血小板源性生長因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)購自Sigma；MTT購自上海碧云天生物技術有限公司；EdU試劑盒購自廣州銳博生物公司；Transwell小室購自Corning；Lipofectamine 2000、TRIzol和qPCR引物購自Invitrogen；抗ROCK1 (Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1)和GAPDH抗體及Ⅱ抗、ECL發(fā)光液購自Santa Cruz。

2 實驗方法

2.1細胞分組 血管平滑肌細胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，放置于5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞匯合度達80%時進行傳代。當細胞達到80%的匯合度時，對細胞進行無血清培養(yǎng)24 h。將細胞隨機分組為對照(control)組、PDGF-BB組、PDGF-BB+對照siRNA(si-NC)組和PDGF-BB+ ZFAS1-siRNA(si-ZFAS1)組。Control組不做任何干預，PDGF-BB組加入20 μg/L PDGF-BB干預；PDGF-BB+si-NC組和PDGF-BB+si-ZFAS1組分別轉染對照siRNA和ZFAS1-siRNA后用20 μg/L PDGF-BB干預。為了進一步驗證ZFAS1和miR-150的調控作用，再將細胞隨機分組為以下4組：PDGF-BB組、PDGF-BB+si-ZFAS1組、PDGF-BB+si-ZFAS1+anti-NC組和PDGF-BB+si-ZFAS1+anti-miR-150組。前2組處理如前所述，后2組在轉染ZFAS1-siRNA的同時分別轉染miR-150抑制劑對照(anti-NC)和miR-150抑制劑(anti-miR-150)。

2.2細胞轉染 將VSMCs接種于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，放置在5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中過夜，然后按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行操作，將si-NC、si-ZFAS1、anti-NC和anti-miR-150轉染到細胞中，轉染48 h后，加入20 μg/L PDGF-BB繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3Real-time PCR檢測ZFAS1、miR-150和ROCK1表達水平 用 TRIzol提取細胞的總RNA，分光光度計測定RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。ZFAS1上游引物序列為5’-ACGTGCAGACATCTACAA-3’，下游引物序列為5’- TACTTCCAACACCCGCAT-3’；miR-150上游引物序列為5’-GAAGATCTTCTACTTTGCGCA-3’，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGCGGCCCTTGCTG-3’；內參照U6 上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物序列為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’；ROCK1上游引物序列為5’-AACATGCTGCTGGATAAATCT-3’,下游引物序列為5’-TGTATCACATCGTACCATGCC-3’；內參照GAPDH上游引物序列為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGATT-3’。PCR條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法進行結果分析。

2.4MTT實驗檢測VSMCs活力 將按上述分組要求處理的細胞調整濃度為1×107/L，取100 μL接種于96孔板，每組重復4個孔，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中過夜，每孔加入10 μL MTT溶液，孵育2 h，測定450 nm處各孔的吸光度(A)值，計算出細胞活力。

2.5EdU染色檢測VSMCs增殖 將按上述分組要求處理的細胞調整濃度為1×107/L，取100 μL接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，加入含50 μmol/L EdU的培養(yǎng)液孵育2 h。根據(jù)試劑盒進行細胞固定以及DNA染色，熒光顯微鏡下觀察，每孔隨機選擇3個視野，計算染色細胞核占相應總細胞的百分比。

2.6Transwell實驗檢測VSMCs遷移能力 將轉染48 h后的細胞調整濃度為1×108/L，在上室加入200 μL細胞懸液，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS清洗3次，用甲醛固定10 min，加入0.1%的結晶紫溶液進行染色15 min，PBS洗3次，用棉簽輕輕拭去小室膜內側細胞，取下室膜平鋪于載玻片上，顯微鏡下隨機觀察3個視野的細胞數(shù)量。

2.7Western blot檢測ROCK1蛋白的表達水平 按上述分組要求處理細胞后，提取細胞蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。取40 μg總蛋白進行SDS-PAGE，電泳結束后將其轉至PVDF膜，室溫下用5%的BSA脫脂奶粉封閉30 min，加抗ROCK1和GAPDH Ⅰ抗置于4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入Ⅱ抗于室溫下孵育2 h，TBST洗膜后用ECL液進行化學發(fā)光反應并曝光。以GAPDH為內參照，用Quantity One軟件對條帶灰度值進行測量并分析。

2.8螢光素酶報告基因實驗 構建野生型和突變型的ROCK1螢光素酶報告質粒載體，將VSMCs按每孔1×105接種于24孔板，24 h后用Lipofectamine 2000分別與anti-NC 和anti-miR-150共轉染進入VSMCs，24 h后用雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測海腎和螢火蟲螢光素酶活性，以海腎螢光素酶為內參照，實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件，采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，每組實驗重復3次，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 PDGF-BB誘導ZFAS1表達上調

通過real-time PCR檢測VSMCs中的ZFAS1表達，結果顯示，與control組相比，PDGF-BB組VSMCs中的ZFAS1表達顯著上調(P<0.05)，見圖1。

2 下調ZFAS1表達可抑制PDGF-BB誘導的VSMCs增殖

用siRNA干擾ZFAS1的表達后用real-time PCR檢測VSMCs中ZFAS1的表達水平，結果顯示，與PDGF-BB組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1組中ZFAS1表達水平顯著下調(P<0.05)，見圖2A。MTT結果顯示，與control組相比，PDGF-BB組的VSMCs活力顯著增強(P<0.05)；與PDGF-BB組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1組VSMCs活力顯著降低(P<0.05)，見圖2B。EdU染色結果顯示，與control組相比，PDGF-BB組的VSMCs增殖能力顯著增強(P<0.05)；與PDGF-BB組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1組VSMCs增殖能力顯著降低(P<0.05)，見圖2C。

Figure 1.PDGF-BB promoted ZFAS1 expression in vascular smooth muscle cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1 PDGF-BB促進血管平滑肌細胞ZFAS1表達

3 下調ZFAS1表達可抑制PDGF-BB誘導的VSMCs遷移

Transwell實驗觀察VSMCs的遷移能力，結果顯示，與control組相比，PDGF-BB組的VSMCs遷移數(shù)目顯著增多(P<0.05)；與PDGF-BB組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1組VSMCs遷移數(shù)目顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 ZFAS1下調miR-150的表達

Real-time PCR檢測miR-150的表達，結果顯示，與control組相比，PDGF-BB組miR-150表達顯著降低(P<0.05)；與PDGF-BB組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1組miR-150表達顯著增加(P<0.05)，見圖4。

5 ZFAS1上調ROCK1的表達

Real-time PCR和Western blot檢測ZFAS1對ROCK1 mRNA和蛋白表達的影響，結果顯示，與control組相比，PDGF-BB組ROCK1 mRNA和蛋白表達顯著增加(P<0.05)；與PDGF-BB組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1組ROCK1 mRNA和蛋白表達顯著下降(P<0.05)，見圖5。

6 miR-150與ROCK1相結合并抑制ROCK1表達

生物信息學軟件預測miR-150和靶基因ROCK1有結合位點，見圖6A。螢光素酶報告基因實驗結果顯示，在野生型螢光素酶中轉入anti-miR150后，螢光素酶活性顯著高于anti-NC組的螢光素酶活性(P<0.05)；而對于突變型螢光素酶，2組的螢光素酶活性無顯著變化，見圖6B。用Western blot實驗檢測到轉入anti-miR-150后，VSMCs中的ROCK1蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)，見圖6C。

Figure 2.si-ZFAS1 inhibited PDGF-BB-induced proliferation of vascular smooth muscle cells. A: the mRNA expression of ZFAS1 was detected by real-time PCR; B: the cell viability was detected by MTT assay; C: the cell proliferation was detected by EdU staining. The nucleus is blue and the EdU is red. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPDGF-BB group.

圖2 si-ZFAS1抑制PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞增殖

Figure 3.si-ZFAS1 inhibited PDGF-BB-induced migration of vascular smooth muscle cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPDGF-BB group.

圖3 si-ZFAS1抑制PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞遷移

Figure 4.ZFAS1 down-regulated the expression of miR-150. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPDGF-BB group.

圖4 ZFAS1下調miR-150的表達

7 ZFAS1通過調節(jié)miR-150/ROCK1調控VSMCs增殖和遷移

用Starbase和TargetScan軟件分析得到，ZFAS1和RCOK1與miR-150具有相同的結合位點，見圖7A。用real-time PCR檢測加入anti-miR-150的VSMCs中的miR-150表達水平，結果顯示，與PDGF-BB+si-ZFAS1組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1+anti-miR-150組中miR-150表達顯著下降(P<0.05)，見圖7B。進一步用real-time PCR檢測ROCK1 mRNA表達，結果顯示，與PDGF-BB+si-ZFAS1組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1+anti-miR-150組中RCOK1 mRNA表達顯著上調(P<0.05)，見圖7C。此外，與PDGF-BB+si-ZFAS1組相比，PDGF-BB+si-ZFAS1+anti-miR-150組中VSMCs增殖和遷移能力顯著增強(P<0.05)，見圖7D～F。

Figure 5.ZFAS1 up-regulated the expression of ROCK1. A: the mRNA expression of ROCK1 was detected by real-time PCR; B: the protein expression of ROCK1 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPDGF-BB group.

圖5 ZFAS1上調ROCK1的表達

討 論

VSMCs的增殖和遷移是動脈粥樣硬化的重要機制之一，抑制VSMCs增殖和遷移可以延緩動脈粥樣硬化進展。本研究通過PDGF-BB誘導VSMCs增殖和遷移，顯示增殖和遷移的VSMCs中ZFAS1的表達上調，而下調ZFAS1后，VSMCs的增殖和遷移受到抑制。這些結果表明ZFAS1在動脈粥樣硬化中起著促進VSMCs增殖和遷移的作用。

ZFAS1作為新的lncRNA在乳腺癌患者中被首次報道，隨后被報道在多種腫瘤中扮演致癌基因角色[6]。近年來ZFAS1在心血管疾病中的作用也被報道。已有研究報道ZFAS1可以作為急性心肌梗死的獨立預測因子[7]。Wu等[8]報道ZFAS1/miR-150軸通過調節(jié)CRP參與急性心肌梗死誘導的心肌細胞凋亡的分子機制。lncRNA可以作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)與miRNA相互作用，參與調控靶基因的表達，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[9]。lncRNA TUG1在自發(fā)性高血壓大鼠的主動脈中高表達，TUG1通過調控miR-145/FGF10促進VSMCs在高血壓狀態(tài)下的增殖和遷移[10]。Ahmed等[11]表明lncRNA NEAT1促進VSMCs

Figure 6.miR-150 bound to the 3’-UTR of ROCK1 and regulated the protein level of ROCK1 in VSMCs. A: the binding sites of miR-150 on the ROCK1 mRNA 3’-UTR; B: the relative luciferase activity was detected by dual-luciferase reporter assay; C: the expression of ROCK1 protein was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsanti-NC group.

圖6 miR-150靶向調控ROCK1的表達

Figure 7.ZFAS1 regulated proliferation and migration of VSMCs by regulating miR-150/ROCK1. A: bioinformatic analysis for the binding sites of ZFAS1 or ROCK1 to miR-150; B: the expression of miR-150 was detected by RT-PCR; C: the expression of ROCK1 mRNA was detected by RT-PCR; D: the VSMC viability was detected by MTT assay; E: the VSMC proliferation was detected by EdU staining; F: the VSMC migration was detected by Transwell assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPDGF-BB group;#P<0.05vsPDGF-BB+si-ZFAS1 group.

圖7 ZFAS1通過調節(jié)miR-150/ROCK1調控VSMCs增殖和遷移

增殖和遷移。本研究觀察到ZFAS1促進VSMCs增殖和遷移，但是，ZFAS1在動脈粥樣硬化中對VSMCs的具體作用尚未報道，ZAFS1可以下調miR-150的表達同時上調ROCK1的蛋白表達水平，進一步通過生物信息學檢測到ZFAS1和miR-150具有結合位點，揭示ZAFS1或許是通過調節(jié)miR-150/ROCK1軸參與動脈粥樣硬化的發(fā)展。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性小的非編碼RNA分子，通過結合靶基因，降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯，從而在轉錄后水平調控基因的表達[12]。miRNA在細胞分化、增殖、遷移和凋亡中起關鍵作用，參與各種疾病的發(fā)展，包括心血管疾病，并被作為臨床診斷和治療靶點來研究[13]。miR-214通過抑制靶基因NCKAP1表達抑制VSMCs增殖和遷移[14]。 miR-132通過調控靶基因PTEN表達降低VSMCs增殖和遷移[15]。ROCK是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，調節(jié)肌動蛋白細胞骨架，已有越來越多的研究證據(jù)表明ROCK1在心血管系統(tǒng)中扮演重要作用[16]。ROCK1缺乏可抑制巨噬細胞趨化，減少修飾LDL攝取和防止泡沫細胞形成從而減輕動脈粥樣硬化[17]。miR-145通過調控ROCK1減輕高糖導致的VSMCs增殖和遷移[18]。本研究通過生物信息學檢測到ROCK1是miR-150的靶基因，并用螢光素酶報告基因實驗證實了靶向關系，并進一步觀察到在VSMCs中抑制ZFAS1后，anti-miR-150可以上調ROCK1表達，促進VSMCs的增殖遷移，由此可以推測ZFAS1可能通過抑制miR-150表達促進VSMCs增殖和遷移。

綜上所述，本研究明確了ZFAS1通過調控miR-150/ROCK1促進VSMCs增殖和遷移。這表明抑制ZFAS1表達可能是防治動脈粥樣硬化的新靶點。但是，關于ZFAS1是否在動脈粥樣硬化動物體內發(fā)揮相關作用及其具體機制尚不清楚，仍需進一步深入研究。