王 倩， 朱建兵， 吳承高， 鄒 娟， 李 松， 胡飄萍， 樂愛平△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1輸血科， 2心內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

血行轉(zhuǎn)移微環(huán)境對肺癌轉(zhuǎn)移的影響越來越受到人們的重視。已知血小板廣泛參與炎癥、血管止血、血栓形成和動脈粥樣硬化等病理生理過程[1]，諸多證據(jù)表明，血小板亦可在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和惡性間皮瘤等惡性腫瘤中聚集并活化，且與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[2-3]?？寡“逅幬?如肝素)的應(yīng)用可明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，提示抑制血小板活化可能成為腫瘤治療的潛在靶點。目前血小板活化影響腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未明確，相關(guān)研究揭示血小板活化標(biāo)志物P-選擇素(P-selectin)可能是血小板與腫瘤細(xì)胞相互作用的重要黏附分子[4]。

P-selectin是選擇素超家族中的主要成員，其家族成員還包括E-選擇素和L-選擇素等。正常情況下，P-selectin主要位于血小板α顆粒和血管內(nèi)皮細(xì)胞棒管狀小體(Weibel-Palade小體)，靜息時血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面不表達(dá)或持續(xù)低表達(dá)P-selectin；當(dāng)血小板激活后，α顆粒與血小板膜融合使P-selectin快速遷移至血小板表面[5]，因此，P-selectin可作為血小板激活的標(biāo)志物[1-2]。研究表明，腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)血小板聚集活化，而血小板活化及其活化表達(dá)的P-selectin是否參與腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移并不十分清楚。Yan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者血清中P-selectin、血管細(xì)胞黏附分子1和細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)水平均明顯高于對照組；P-selectin缺陷的小鼠模型中，肺癌轉(zhuǎn)移得到有效抑制；提示P-selectin可能與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但P-selectin調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明，其在血小板影響肺癌血行轉(zhuǎn)移中的作用也不十分清楚。本文擬探討活化血小板表面的P-selectin與肺癌臨床病理特征及血行轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并初步研究其在肺癌血行轉(zhuǎn)移中的作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步明確肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)理、尋找新的治療手段奠定理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

用于外周血血小板計數(shù)(blood platelet count，BPC)的標(biāo)本采取自2015年1月～2017年6月242例在我院呼吸科和腫瘤科初診的原發(fā)性肺癌患者，邁瑞全自動血細(xì)胞分析儀(BC-5000)自動計數(shù)外周血血小板數(shù)量。全部病例均經(jīng)纖維支氣管鏡活檢、經(jīng)皮肺穿刺或胸膜活檢等組織病例學(xué)確診，并通過胸部CT等，按國際抗腫瘤聯(lián)盟(UICC)2016修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第8版)進(jìn)行分期評估。病例包括非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)，其中肺鱗癌(squamous-cell carcinoma，SCC)96例，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LAC) 85例，SCLC 61例，并排除其它疾病干預(yù)因素。所有病例在檢測前2周均未服用影響血小板功能的藥物。

2 材料

人LAC細(xì)胞系A(chǔ)549、人肺SCC細(xì)胞系H520、人SCLC細(xì)胞系H446和人肺泡上皮細(xì)胞(human alveolar epithelial cells, HPAECs)均購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。鼠抗人P-selectin單克隆抗體和鼠抗人P-選擇素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)單克隆抗體(Santa Cruz)；pSilen-cer-PSGL-1-shRNA (李明宇課題組贈予)。

3 方法

3.1血小板分離提取 病例晨起空腹采血7 mL， 2 500 r/min離心12 min，取上層血漿進(jìn)行500 r/min二次離心6 min，即分出上層濃縮血小板血漿。再次重離心(3 200 r/min，30 min，4 ℃)后丟棄上清收集血小板[7]。將收集的血小板用0.01 mol/L PBS洗滌2次(3 200 r/min，30 min，4 ℃)，以10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸備用。

3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板P-selectin的表達(dá) 將收集的外周血血小板分離純化后，每管加0.01 mol/L PBS 50 μL重懸，加入抗P-selectin抗體5 μL (1∶50)，37 ℃孵育1 h，然后0.01 mol/L PBS洗脫2次(3 000 r/min，3.5 min)，棄上清后加入FITC標(biāo)記的 II 抗(1∶50)5 μL，再用0.01 mol/L PBS洗脫2次(3 000 r/min，3.5 min)后上機(jī)檢測。

3.3血小板和肺癌細(xì)胞共培養(yǎng) 將前述提取的血小板進(jìn)行P-selectin表達(dá)檢測，根據(jù)檢測結(jié)果分為P-selectin高表達(dá)組(≥60%)和P-selectin低表達(dá)(<20%)組，并分別以含10% FBS的DMEM重懸，調(diào)整血小板計數(shù)為3×1011/L備用。在接種于6孔板并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h的肺癌細(xì)胞中加入各組血小板200 μL，共培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗或檢測。

3.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行鋪板，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，6孔板細(xì)胞每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒4 μg，將質(zhì)粒加入250 μL無血清培養(yǎng)基中，將脂質(zhì)體10 μL加入250 μL無血清培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min。后混合Lipofectamine 2000和質(zhì)粒的稀釋液，輕輕混勻并于室溫下靜置20 min。pSilencer-PSGL-1-shRNA質(zhì)粒和pSilencer空載體分別與脂質(zhì)體孵育，轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞。4 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。

3.5RT-qPCR分析 收集細(xì)胞加入1 mL TRIzol并按操作說明提取總RNA、測定RNA濃度。以1 μg RNA為模板，按RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄cDNA；以1 μL cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系為10 μL，包括SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×) 5.0 μL、引物0.2 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 3.8 μL；反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算結(jié)果。PSGL-1的上游引物序列為5’-TGAGTCTACCACTGTGGAGCC-3’，下游引物序列為5’-GGTT-GAGTGGTCTGTATCTCC-3’；ITGB3的上游引物序列為5’-TCATCACCATCCACGACC-3’，下游引物序列為5’-CCACATACTGACATTCTCCC-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CCCATGTTCGTCATGGGTGT-3’，下游引物序列為5’-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3’。

3.6Western blot實驗 用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA法對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，經(jīng)SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)模、脫脂牛奶封閉后，加入 I 抗4 ℃過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min,加入相應(yīng) II 抗孵育1 h，1×TBST洗膜3次。自動曝光儀曝光獲取圖像。ImageJ軟件分析蛋白質(zhì)和GAPDH內(nèi)參照的灰度，計算灰度比值。

3.7Transwell侵襲實驗 無血清培養(yǎng)基8∶1稀釋Matrigel均勻鋪于Transwell小室，每孔50 μL，37 ℃ 30 min。各組細(xì)胞以每孔5×104個/孔接種于Transwell小室，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于含有10 % FBS培養(yǎng)基的24孔板上，5 % CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。甲醛固定10～20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，濕棉棒輕輕擦去上層未遷移細(xì)胞，PBS洗3遍，顯微鏡下觀察細(xì)胞并計數(shù)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計量資料均經(jīng)過Shapiro-Wilk正態(tài)檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))表示，兩組比較用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料比較用2檢驗，當(dāng)理論頻數(shù)小于5，改用Fisher確切概率法;多組間比較先采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或Kruskal-Wallis檢驗，后采用SNK-q檢驗或Dunn-Bonferroni檢驗進(jìn)行多組間兩兩比較;相關(guān)性分析采用Bivariate Correlations 分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 健康對照及不同病理類型肺癌患者外周血的BPC水平

30例健康對照BPC中位數(shù)為191.00(150.25，227.75)×109/L。242例肺癌患者中，肺SCC 96例，BPC中位數(shù)為248.5(215.0，307.0)×109/L；LAC 85例，BPC中位數(shù)為287.0(220.0，343.0)×109/L；SCLC 61例，BPC中位數(shù)為275.0(227.0，324.0)×109/L。肺SCC、LAC及SCLC中BPC明顯高于健康對照(P<0.05)；3種病理類型中LAC的BPC水平有增高趨勢，但各組間比較無顯著差異，見圖1。

Figure 1.The levels of peripheral blood platelet count (BPC) in healthy controls (HC)， and lung squamous-cell carcinoma (SCC), lung adenocarcinoma (LAC) and small-cell lung cancer (SCLC) patients. Median (Q1,Q3).*P<0.05vsHC group.

圖1 正常健康對照及不同病理類型肺癌患者BPC水平的比較

2 外周血BPC與肺癌TNM分期的關(guān)系

不同TNM分期(T1+2vsT3+4； N0vsN1vsN2)及臨床分期(Ⅰ+ⅡvsⅢ+Ⅳ)之間BPC的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 BPC水平與肺癌臨床分期的相關(guān)性分析

Table 1.The correlation between the periphery BPC level and the clinical stage of the lung cancer patients

GroupCasesBPC (×109/L)PT stage T1+2165278.0 (224.0, 337.0)0.0008 T3+477314.0 (246.0, 404.0)N stage N0115278.0 (225.5, 341.5)0.0104 N167283.0 (217.5, 325.0) N260315.5 (246.5,405.25)TNM stageⅠ+Ⅱ158278.0 (225.5, 341.5)0.0040Ⅲ+Ⅳ84309.5 (236.8, 399.0)

3 血小板P-selectin水平與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測肺癌患者外周血血小板P-selectin的水平發(fā)現(xiàn)，LAC患者的P-selectin表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)，且高于SCC組和SCLC組(P<0.05)；而SCC組和SCLC組分別與對照組比較均顯著升高(P<0.05)，但SCC組與SCLC組之間比較的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2.The P-selectin expression on activated platelets in the patients with lung cancer. Median (Q1,Q3).*P<0.05vsHC group;#P<0.05vsSCC group;△P<0.05vsSCLC group.

圖2 肺癌患者血小板活化表達(dá)P-selectin水平的比較

4 血小板P-selectin水平與肺癌遠(yuǎn)處血行轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

本研究檢測的83例肺癌患者中，發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的32例。流式細(xì)胞術(shù)檢測患者血小板活化后表達(dá)的P-selectin水平，結(jié)果顯示患者的P-selectin水平均數(shù)為(48.05±16.87)%，據(jù)此將患者分為2組(≥48%和<48%)。采用相關(guān)分析探討P-selectin對肺癌患者發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，結(jié)果顯示P-selectin水平和血行轉(zhuǎn)移的相關(guān)系數(shù)為0.256(P<0.05)，提示兩者間存在明顯相關(guān)性，見表2。

表2 患者血小板活化表達(dá)P-selectin水平與肺癌血行轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

Table 2.The correlation between the P-selectin expression level on activated platelets and the hematogenous metastasis of primary lung cancer

FactorsCode01rPP-selectin (n)<48%(46)≥48%(37)0.2560.013Hematogenous metastasis (n)Negative (51)Positive (32)

5 不同類型肺癌細(xì)胞系PSGL-1的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，A549和H520細(xì)胞中PSGL-1的表達(dá)較HPAECs顯著升高(P<0.05)；而H446細(xì)胞中PSGL-1的表達(dá)較弱，與HPAECs比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖3。

Figure 3.The expression levels of PSGL-1 in different types of lung cancer cell lines. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHPAECs group;#P<0.05vsA549 group;△P<0.05vsH520 group.

圖3 不同類型肺癌細(xì)胞系PSGL-1表達(dá)水平的比較

6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲減肺癌細(xì)胞PSGL-1表達(dá)后其侵襲力及ITGB3表達(dá)水平的變化

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSilencer-PSGL-1-shRNA 后，采用RT-qPCR檢測細(xì)胞PSGL-1 的mRNA水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pSilencer-PSGL-1-shRNA質(zhì)?？娠@著抑制PSGL-1的表達(dá)(P<0.05)，見圖4A。

采用Transwell小室實驗觀察P-selectin與其配體PSGL-1相互作用對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，細(xì)胞分為A549+P-selectin低表達(dá)血小板組、A549+P-selectin高表達(dá)血小板組和A549+shRNA+P-selectin高表達(dá)血小板組，結(jié)果表明高P-selectin表達(dá)血小板與肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)組細(xì)胞侵襲力和整合素β3 (integrin β3，ITGB3)水平均明顯升高，干擾肺癌細(xì)胞PSGL-1表達(dá)后，細(xì)胞跨膜侵襲和ITGB3水平均受到明顯抑制(P<0.05),見圖4B、C。

討 論

血行轉(zhuǎn)移是肺癌的重要惡性特征，也是患者預(yù)后不良的主要原因之一。近來，血小板活化與腫瘤發(fā)生、特別是腫瘤血行轉(zhuǎn)移的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注，研究證實高BPC是臨床癌癥患者靜脈血栓形成最重要的、也是獨(dú)立危險因素[8]。我們對不同臨床分期和病理類型的肺癌患者進(jìn)行外周血BPC檢測，提示肺癌患者BPC增高與肺癌發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性，初步證實了血小板的促肺癌血行轉(zhuǎn)移作用，但血小板影響癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確。

Figure 4.The changes of PSGL-1 (A) and ITGB3 (B) mRNA expression and the invasion ability of the lung cancer cells (C) after plasmid transfection. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA549 group;#P<0.05vsA549+low P-selectin group;△P<0.05vsA549+high P-selectin group.

圖4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞后PSGL-1表達(dá)、侵襲力及ITGB3水平的變化

腫瘤血行轉(zhuǎn)移過程需多種黏附分子共同參與，且存在細(xì)胞外基質(zhì)及血細(xì)胞間的相互作用。血液中的腫瘤細(xì)胞通過激活血小板，誘導(dǎo)其聚集在瘤細(xì)胞周圍形成瘤栓，一方面實現(xiàn)“免疫逃逸”；另一方面幫助腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，為血行轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。血小板活化標(biāo)志物——P-selectin作為一種重要的細(xì)胞黏附分子，通常情況下存在于血小板α顆?；蜓軆?nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體中，血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面不表達(dá)或低表達(dá)。當(dāng)凝血酶、腫瘤壞死因子和鈣離子載體等物質(zhì)刺激后，P-selectin迅速表達(dá)于血小板表面參與多種生物活動，其水平增高常見于動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征和腦血管栓塞等疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，P-selectin在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9]；在結(jié)直腸癌患者中，P-selectin水平顯著高于健康對照組，且與無轉(zhuǎn)移組比較，轉(zhuǎn)移組P-selectin水平顯著升高[10]；膀胱癌患者血清中P-selectin和細(xì)胞間黏附分子1均明顯高于對照組，且P-selectin升高與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而這些研究大多檢測的是血清中游離的P-selectin，其來源可能是血小板或血管內(nèi)皮，還有可能來自腫瘤細(xì)胞自身。為揭示瘤細(xì)胞與活化血小板的直接關(guān)系，本研究對患者外周血血小板表面P-selectin進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示肺癌患者血小板P-selectin比率明顯高于健康對照組，且肺腺癌組表達(dá)最高。同時，活化血小板的P-selectin水平與肺癌尤其是肺腺癌血行轉(zhuǎn)移之間存在明顯相關(guān)。

進(jìn)一步地，我們通過體外實驗研究血小板P-selectin促進(jìn)肺癌血行轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。研究表明，選擇素發(fā)揮功能需要與其特異性配體結(jié)合，從而實現(xiàn)細(xì)胞間的接觸、黏附乃至信號傳導(dǎo)[11]。有跡象表明P-selectin可通過與瘤細(xì)胞表面配體結(jié)合調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]，然而不同類型腫瘤細(xì)胞P-selectin配體的表達(dá)不盡相同，如前列腺癌高表達(dá)配體PSGL-1、乳腺癌高表達(dá)配體CD24等[13]，其中PSGL-1是P-selectin的重要配體之一，相對分子質(zhì)量為120 kD，其糖鏈富含唾液酸和巖藻糖結(jié)構(gòu)，易與選擇素結(jié)合[11]。Raes等[14]證實，PSGL-1在淋巴瘤血行轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，而PSGL-1是否參與肺癌血行轉(zhuǎn)移尚不明確。我們通過研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞尤其是肺腺癌細(xì)胞PSGL-1表達(dá)增高，而肺腺癌是肺癌中較多發(fā)生遠(yuǎn)處血行轉(zhuǎn)移的病理類型，因此我們推測活化血小板P-selectin與其配體PSGL-1結(jié)合可能是肺腺癌血行轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[15-16]，而小細(xì)胞肺癌由于其與非小細(xì)胞肺癌起源和生物學(xué)特性不同，二者轉(zhuǎn)移機(jī)制可能有所差異[5,17]。通過Transwell實驗對不同干預(yù)下肺癌細(xì)胞侵襲力進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P-selectin高表達(dá)血小板共培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞與對照組比較跨膜侵襲力明顯增強(qiáng)；特異性干擾肺癌細(xì)胞PSGL-1表達(dá)后，肺癌細(xì)胞跨膜侵襲力受到抑制。與此同時本實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制PSGL-1表達(dá)后，癌細(xì)胞上整合素ITGB3水平也顯著降低，而整合素可通過促進(jìn)細(xì)胞骨架重排、增強(qiáng)腫瘤變形能力以及通過調(diào)節(jié)腫瘤與細(xì)胞基質(zhì)黏附促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移近來在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用逐漸受到重視，提示血小板P-selectin與配體PSGL-1結(jié)合促進(jìn)肺癌進(jìn)展與ITGB3水平升高有關(guān)。