王思萱， 龍露葉， 方雪嬌， 徐建昕， 錢詩(shī)菡， 呂建新

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 溫州 325035)

結(jié)直腸癌是位列于肺癌、肝癌和胃癌后的第4種致死惡性腫瘤，每年約70萬(wàn)人死于結(jié)腸癌[1]，我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率正逐年上升[2]。近年全球?qū)τ诮Y(jié)腸癌的篩查技術(shù)如大便隱血、基因檢測(cè)和結(jié)腸膠囊內(nèi)鏡等已經(jīng)逐步推廣，成為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。研究者們也在開發(fā)能替代侵入性結(jié)腸鏡檢查的新型檢測(cè)方法[1]。

1973年Goodwin等[3]發(fā)現(xiàn)一組具有高電泳遷移率的非組蛋白，即高遷移率族(high mobility group，HMG)蛋白，其中包括HMGB、HMGA和HMGN 3個(gè)超家族。HMGB1在細(xì)胞內(nèi)是高度保守的DNA伴侶蛋白，而在胞外是一種典型的炎癥因子，與細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子共同發(fā)揮作用[4]。近年研究表明，HMGB1不僅參與炎癥性疾病進(jìn)程，還與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)[5-7]，HMGB1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，但具體的作用機(jī)制尚不明確[8]。本項(xiàng)工作通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC中HMGB1的表達(dá)情況，體外構(gòu)建HMGB1表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，并分析下調(diào)HMGB1表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，以探討HMGB1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人結(jié)腸上皮細(xì)胞株FHC和結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 主要試劑

胎牛血清(Lonsera)；Matrigel 基質(zhì)膠(BD)；RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)；CCK-8試劑(Dojindo)；兔抗c-Myc單克隆抗體、兔抗p-ERK單克隆抗體、兔抗ERK多克隆抗體、兔抗人HMGB1單克隆抗體、兔抗E-cadherin單克隆抗體、兔抗N-cadherin單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體和兔抗Bcl-2單克隆抗體(Abcam)；兔抗人MMP-2/9單克隆抗體(華安生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人GAPDH單克隆抗體(杭州戴格生物技術(shù)有限公司)；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；QuantiFast SYBR Green PCR Kit(QIAGEN)；無(wú)義序列shNC(5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)，shHMGB1(5’-CCCGTTATGAAAG-AGAAATGA-3’)由上海吉瑪生物公司合成；HMGB1和GAPDH引物(HMGB1：上游5’-GGCCTTCTTCCTCTTCTGCT-3’，下游5’-GCAACATCACCAATGGACAG-3’；GAPDH：上游5’-GCCAGTGGACTCCACG-AC-3’，下游5’-CAACTACATGGTTTACATGTTC-3’)由Tsingke合成。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC和結(jié)腸癌SW620細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%鏈青霉素)置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，按1 ∶2或1 ∶3傳代培養(yǎng)

3.2轉(zhuǎn)染及分組 將SW620細(xì)胞消化后接種于6孔板內(nèi)，每個(gè)孔接種3×104個(gè)細(xì)胞，放置于37 ℃、 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，根據(jù)Lipofectamine 3000試劑盒說(shuō)明書的轉(zhuǎn)染試劑配比，將含5 μg目的質(zhì)粒的稀釋液加入含有3.75 μL Lipofectamine 3000的稀釋液中混勻，室溫孵育5～10 min后加入6孔板孵育，2 d后更換完全培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)G418篩選14 d構(gòu)建穩(wěn)定shHMGB1和shNC組細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)分組情況：空白對(duì)照組(blank組，未做任何處理的SW620細(xì)胞)、陰性對(duì)照組即shNC組(轉(zhuǎn)染shNC質(zhì)粒的SW620細(xì)胞)和HMGB1低表達(dá)組即shHMGB1組(轉(zhuǎn)染shHMGB1質(zhì)粒的SW620細(xì)胞)。

3.3qPCR檢測(cè)基因表達(dá) TRIzol法提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR采用20 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，對(duì)比不同組基因在轉(zhuǎn)錄水平的差異，ΔCt =Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，ΔΔCt=ΔCt(樣本)-ΔCt(對(duì)照組)。

3.4細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定結(jié)腸癌SW620細(xì)胞活力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞按每孔5×103個(gè)接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后，每組3個(gè)復(fù)孔，在常規(guī)培養(yǎng)0、24、48、72和96 h后，加入CCK-8溶液每孔10 μL，37 ℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值(A值)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

3.5平板集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化，按每孔500個(gè)接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)14 d，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)集落后，無(wú)水甲醇固定20 min，去除固定液后加入結(jié)晶紫染色15 min，去除染色液后沿壁加入蒸餾水輕柔洗脫染色液，靜置干燥。肉眼計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)，以集落形成率表示細(xì)胞生長(zhǎng)情況，集落形成率(%)=集落個(gè)數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

3.6細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 采用Transwell法，在小室上室加入200 μL以無(wú)血清培養(yǎng)液重懸的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)每孔1×105個(gè)，下室加入600 μL含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃下培養(yǎng)48 h，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫溶液染色15 min，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野拍照(×100)并做相應(yīng)記錄，計(jì)算穿過(guò)膜后下室表面的細(xì)胞數(shù)量，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，比較細(xì)胞遷移能力的差異。

3.7細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 采用Transwell法，使用10% Matrigel包被小室上室，隨后加入200 μL以無(wú)血清培養(yǎng)液重懸的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)每孔1.2×105個(gè)，下室加入600 μL含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃下培養(yǎng)48 h，用4%多聚甲醛固定膜下室面的細(xì)胞，去除固定液用結(jié)晶紫溶液染色15 min，隨機(jī)取5個(gè)視野(×100)，計(jì)數(shù)膜下室表面細(xì)胞，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，比較細(xì)胞侵襲能力的差異。

3.8Western blot 將細(xì)胞經(jīng)RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解20 min 后，離心收集上清，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，變性，分裝后于-80 ℃凍存。以每孔20 μg總蛋白上樣，濃縮膠70 V電泳30 min， 分離膠110 V 電泳1.5 h。常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后加入I抗[抗HMGB1(1 ∶5 000)、c-Myc(1 ∶1 000)、p-ERK(1 ∶1 000)、ERK(1 ∶1 000)、MMP-2/9(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶2 000)、N-cadherin(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)及 GAPDH(1 ∶1 000)抗體]，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入II抗(1 ∶1 000)于37℃孵育1h，TBST 漂洗3次，ECL液顯影，ImageJ分析軟件對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行定量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均獨(dú)立重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中HMGB1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC(P<0.01)，見(jiàn)圖1A；Western blot結(jié)果顯示，結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)顯著高于FHC細(xì)胞(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The expression level of HMGB1 in FHC cells and colon cancer SW620 cells. A: the mRNA expression of HMGB1 was detected by qPCR; B: the protein expression was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsFHC cells.

圖1 在結(jié)腸癌SW620細(xì)胞與正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC中HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平

2 構(gòu)建HMGB1表達(dá)下調(diào)的SW620細(xì)胞株

采用qPCR檢測(cè)HMGB1的表達(dá)量，結(jié)果顯示shHMGB1組中HMGB1的mRNA表達(dá)較blank組和shNC組下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2A;Western blot檢測(cè)HMGB1的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和shNC組比較，shHMGB1組蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2B。

Figure 2.Transfection with shHMGB1 decreased HMGB1 expression in the colon cancer cell line SW620. A: the mRNA expression of HMGB1 was detected by qPCR; B: the protein expression was detemined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank group and shNC group.

圖2 轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞中HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 HMGB1表達(dá)下調(diào)抑制SW620細(xì)胞的活力和平板集落形成能力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同blank組和shNC組相比，shHMGB1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的A值顯著降低，隨時(shí)間延長(zhǎng)，差異逐漸增大(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，shHMGB1實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞平板集落形成能力顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3B。

4 HMGB1表達(dá)下調(diào)抑制SW620細(xì)胞的遷移和侵襲能力

采用Transwell小室分別檢測(cè)下調(diào)表達(dá)HMGB1對(duì)SW620細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，blank組和shNC組穿過(guò)小室遷移的細(xì)胞數(shù)分別為(85.2±32.7)和(58.4±3.5)個(gè)，shHMGB1組為(19.4±5.7)個(gè)，shHMGB1組中穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖3A。侵襲小室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shHMGB1組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)為(15.9±11.4)個(gè)，顯著少于blank組的(91.5±40.6)和shNC組的(51.3±4.9)個(gè)(P<0.01),見(jiàn)圖4B。

5 HMGB1對(duì)SW620細(xì)胞遷移侵襲及凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同blank組和shNC組比較，shHMGB1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中侵襲和遷移相關(guān)蛋白MMP-2、 MMP-9和N-cadherin表達(dá)下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，E-cadherin蛋白在3組間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

6 HMGB1對(duì)ERK/c-Myc信號(hào)通路的影響

Western blot結(jié)果表明，同blank和shNC組相比，shHMGB1實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞ERK表達(dá)無(wú)差異，而p-ERK蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，c-Myc蛋白表達(dá)顯著低于blank和shNC組(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

討 論

我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率分別位居惡性腫瘤中的第3位和第5位[2]。盡管結(jié)腸癌的診療手段不斷改進(jìn)，但結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍嚴(yán)重影響患者預(yù)后及術(shù)后生活質(zhì)量。尋找有效的治療靶點(diǎn)以提高患者生存質(zhì)量或?qū)⒊蔀榻Y(jié)腸癌治療新的突破點(diǎn)[9-10]。MAPK/ERK信號(hào)通路可通過(guò)蛋白泛素化和降解參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且在腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲過(guò)程中通路相關(guān)蛋白異常激活[11]。

HMGB1為細(xì)胞內(nèi)高度保守的DNA結(jié)合蛋白，參與染色質(zhì)構(gòu)建、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并維持核小體結(jié)構(gòu)[12]。HMGB1所處定位決定其主要功能，在胞質(zhì)或線粒體內(nèi)，HMGB1可促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制凋亡，參與調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)和功能；當(dāng)其分泌至細(xì)胞間質(zhì)時(shí)，則參與調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖等[4]。HMGB1在胃癌、肝癌和頭頸癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)[7, 13]。HMGB1促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[14]，表明HMGB1可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

Figure 3.The effect of shHMGB1 on the proliferation of the SW620 cells. A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B: the growth of SW620 cells was detected by colony formation assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsshNC group and blank group.

圖3 HMGB1在SW620細(xì)胞中對(duì)增殖的影響

目前HMGB1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qPCR與Western blot檢測(cè)顯示，結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中HMGB1在mRNA和蛋白水平表達(dá)均高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，表明HMGB1在結(jié)腸癌細(xì)胞中異常高表達(dá)。對(duì)細(xì)胞功能的影響分析顯示，與blank和shNC組相比，shHMGB1組SW620細(xì)胞活力和集落形成能力下降，與在肝癌和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中結(jié)果相符[15-16]，提示HMGB1能夠影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到shHMGB1組細(xì)胞遷移與侵襲的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少，同時(shí)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-me-senchymal transition, EMT)相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，N-鈣黏蛋白、MMP-2及MMP-9表達(dá)降低，與Kuniyasu等[17]的研究具有相同趨勢(shì)，提示抑制HMGB1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞遷移和侵襲功能及相關(guān)蛋白具有抑制作用。有研究報(bào)道ERK通路參與胰腺癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過(guò)程[18-20]，我們觀察到下調(diào)HMGB1降低了p-ERK和c-Myc蛋白表達(dá)，提示HMGB1可能通過(guò)活化ERK通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生影響，同時(shí)觀察到促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，這與Wang等[21]的研究結(jié)果趨勢(shì)一致，同時(shí)在腎癌及血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中也觀察到HMGB1下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22-23]，這提示HMGB1可能參與抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖的過(guò)程，但有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

Figure 4.Downregulation of HMGB1 inhibited the migration (A) and invasion (B) of the SW620 cells. The migration and invasion of SW620 cells were detected by Transwell assays. The scale bar=200 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshNC group and blank group.

圖4 在SW620細(xì)胞中下調(diào)HMGB1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Figure 5.The effects of shHMGB1 on the expression of EMT- and apoptosis-related proteins in the SW620 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsshNC group and blank group.

圖5 HMGB1下調(diào)對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中EMT及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響

Figure 6.The effects of shHMGB1 on the protein levels of c-Myc and p-ERK in the SW620 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshNC group and blank group.

圖6 HMGB1下調(diào)對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中c-Myc、p-ERK及ERK蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，HMGB1在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)異常升高，其基因可能作為致癌基因促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，抑制HMGB1的表達(dá)可降低ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能，同時(shí)影響了EMT相關(guān)蛋白表達(dá)。