聶 佩， 孟凡靜， 張金國， 尉希清

(1濟寧醫(yī)學院臨床醫(yī)學院， 山東 濟寧 272067； 2濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內二科， 山東 濟寧 272092)

心肌細胞凋亡參與多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，如心肌梗死(myocardial infarction，MI)和心力衰竭(heart failure，HF)等，凋亡通路的激活導致了心肌細胞的丟失從而導致心臟功能障礙。血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)是由血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉化酶的作用下，水解產生的多肽物質。既往研究發(fā)現高血壓合并心血管疾病及心力衰竭患者中Ang II水平顯著升高，并表明Ang II參與了心肌細胞肥大及凋亡[1-2]。黃芪甲苷(astragaloside IV，ASIV)是從中藥黃芪中提取出的有效活性物質，具有抗炎、抗氧化和免疫調節(jié)等多種藥理學作用[3-4]。有研究表明ASIV可逆轉Ang II誘導的心肌細胞肥大[5]，但其對Ang II介導的心肌細胞凋亡是否具有保護作用，及其具體機制尚不明確。本研究以Ang II誘導心肌細胞凋亡為基礎，發(fā)現ASIV對Ang II誘導的心肌細胞具有保護作用，并初步探討了其相關機制，為ASIV在心血管疾病方面的應用提供了更有力的證據，為心血管疾病的治療提供了新方向。

材 料 和 方 法

1 細胞及試劑

心肌H9c2細胞購自中科院上海細胞生物學研究所。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自 Gibco；ASIV購自南京春秋生物技術有限公司；Ang II購自上海源葉生物技術有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自北京Apuris生物技術有限公司；Bax兔多克隆抗體、Bcl-2兔多克隆抗體、核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)兔多克隆抗體、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)兔多克隆抗體、β-actin兔多克隆抗體和羊抗兔IgG-HRP均購自ABclonal Technology；一步法 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、DAPI和ECL 顯影液購自碧云天生物技術研究所；Lipofectamine 2000 轉染試劑盒購自Invitrogen。

2 方法

2.1心肌H9c2細胞的培養(yǎng) 心肌H9c2細胞置于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，在 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至培養(yǎng)瓶底面積的90%左右時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代或凍存。

2.2Ang II及ASIV的配制 Ang II溶于PBS中，配制成1 000 μmol/L母液，根據需要濃度再行稀釋。ASIV粉劑先用DMSO溶為溶劑，再溶于含有 10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，DMSO濃度不得超過0.1%[4]。

2.3shRNA轉染 構建并篩選Nrf-shRNA質粒，以3 μg質粒轉染H9c2細胞，轉染方法參照 Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進行，轉染 4 h 后更換有血清 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4H9c2細胞的分組及處理 取對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化后鋪于6孔板或96孔板，待細胞長至80%左右時進行藥物干預。轉染前實驗分為以下6組：(1)對照(control)組：心肌 H9c2細胞普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，未做任何處理；(2)ASIV組：心肌 H9c2細胞中加入100 μmol/L濃度ASIV培養(yǎng)24 h；(3)Ang II組：心肌 H9c2細胞加入1 μmol/L濃度Ang II培養(yǎng)24 h；(4)Ang II+ASIV 25 μmol/L組：用25 μmol/L濃度ASIV預處理心肌 H9c2細胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang II培養(yǎng)24 h；(5)Ang II+ASIV 50 μmol/L組：用50 μmol/L濃度ASIV預處理心肌 H9c2細胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang II培養(yǎng)24 h；(6)Ang II+ASIV 100 μmol/L組：用100 μmol/L濃度ASIV預處理心肌 H9c2細胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang II培養(yǎng)24 h。轉染后分為以下8組：(1)NC+control組：NC質粒轉染后，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，未做任何處理；(2)NC+Ang Ⅱ組：NC質粒轉染后，加入1 μmol/L濃度AngⅡ培養(yǎng)24 h；(3)NC+ASIV組：NC質粒轉染后，加入100 μmol/L濃度ASIV培養(yǎng)24 h；(4)NC+Ang Ⅱ+ASIV組：NC質粒轉染后，用100 μmol/L濃度ASIV預處理H9c2心肌細胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang Ⅱ培養(yǎng)24 h；(5)shRNA+control組：shRNA質粒轉染后，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，未做任何處理；(6)shRNA+Ang Ⅱ組： shRNA質粒轉染后，加入1 μmol/L濃度Ang Ⅱ培養(yǎng)24 h；(7)shRNA+ASIV組：shRNA質粒轉染后，加入100 μmol/L濃度ASIV培養(yǎng)24 h；(8)shRNA+Ang Ⅱ+ASIV組：shRNA質粒轉染后，用100 μmol/L濃度ASIV預處理H9c2心肌細胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang Ⅱ培養(yǎng)24 h。

2.5CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化鋪于96孔板中，使最終密度為每孔4×103，培養(yǎng)12 h后給予藥物干預，24 h后加入CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h后用酶標儀于450 nm測定吸光度(A)值，630 nm作為參考波長進行雙波長測定。

2.6TUNEL檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化后種于6孔板的玻璃爬片上，給予不同藥物干預后，用PBS洗滌1次，再用4%多聚甲醛固定。每張玻片上加入100 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3次后加入含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍片。

2.7DCFH-DA標記法檢測活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平 在6孔板的玻璃爬片中給予不同藥物干預，去除培養(yǎng)基后，加入DCFH-DA 1 mL在37 ℃下培養(yǎng)20 min，然后在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍片。

2.8Western blot檢測蛋白的表達水平 心肌H9c2細胞按上述方法進行藥物干預后，每孔加入蛋白裂解液裂解，提取各組H9c2細胞的蛋白，BCA法進行蛋白濃度檢測，蛋白定量及變性后通過 Western blot 檢測各組心肌細胞中Bax、Bcl-2、Nrf2和HO-1的蛋白表達水平，具體操作參考文獻[6]。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數據采用 SPSS 13.0 進行統(tǒng)計學分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。首先通過單因素方差分析明確各組數據有無統(tǒng)計學差異，對于有統(tǒng)計學差異的采用SNK-q檢驗進行組間多重比較，明確哪兩組間存在差異。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 ASIV對Ang II誘導的心肌 H9c2細胞活力及生長情況的影響

分別用0、0.01、0.1、1、10和100 μmol/L濃度的Ang II干預心肌 H9c2細胞24 h，CCK-8法檢測結果顯示，Ang II可抑制心肌 H9c2細胞的活力，且呈濃度依賴性,其中1、10和100 μmol/L較對照組顯著降低(P<0.05)，見圖1。后續(xù)實驗以1 μmol/L的Ang II為干預濃度。以0、6.25、12.5、25、50和100 μmol/L的ASIV預處理心肌 H9c2細胞30 min, 再使用1 μmol/L Ang II干預24 h，結果顯示ASIV可逆轉Ang II對心肌 H9c2細胞活力的抑制作用，且呈濃度依賴性，其中(6.25～100)μmol/L與0 μmol/L(即Ang II組)相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。后續(xù)實驗以25、50和100 μmol/L的ASIV為梯度干預濃度。圖3為對照組、ASIV組、Ang II組和Ang II+ASIV(25、50和100 μmol/L)組心肌 H9c2細胞的生長狀態(tài)，可以看出:對照組與ASIV組的細胞形態(tài)大致相同，呈長梭狀，胞漿豐富，排列有序；Ang II組心肌細胞呈短梭形，排列紊亂，可見漂浮死亡細胞；Ang II+ASIV組的細胞可見100 μmol/L ASIV預處理組的細胞狀態(tài)與對照組細胞相似。

Figure 1.The effects of Ang II at different concentrations on the viability of H9c2 cardiomyocytes. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 不同濃度Ang II對H9c2心肌細胞活力的影響

Figure 2.The effects of ASIV at different concentrations on the viability of H9c2 cardiomyocytes induced by Ang II. Mean±SD.n=5.*P<0. 05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖2 不同濃度ASIV對Ang II誘導的心肌 H9c2細胞活力的影響

Figure 3.The effects of ASIV on the growth of H9c2 cardiomyocytes treated with Ang II.

圖3 ASIV對Ang II干預的心肌 H9c2細胞生長情況的影響

2 ASIV對Ang II誘導的心肌 H9c2細胞凋亡的影響

TUNEL法檢測細胞凋亡率顯示，與對照組相比，Ang II組的細胞凋亡率明顯增高，ASIV可呈濃度依賴性降低Ang II誘導的心肌細胞凋亡(P<0.05)，見圖4。Ang II組的Bax蛋白表達較對照組呈明顯上升趨勢(P<0.05)，Ang II+ASIV組則較Ang II組下降(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達則與之相反(P<0.05)，且隨ASIV干預濃度不同呈劑量依賴性，見圖5。

Figure 4.The effects of ASIV on the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by Ang II (×100). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖4 ASIV對Ang II誘導的心肌 H9c2細胞凋亡的影響

3 ASIV對Ang II誘導的ROS產生的影響

與對照組相比，ASIV組ROS水平的差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，Ang II組的ROS水平顯著增加，Ang II+ASIV組的ROS水平較Ang II組呈濃度依賴性降低(P<0.05)，見圖6,表明ASIV可降低Ang II誘導的ROS產生。

Figure 5.The effects of ASIV on the levels of apoptosis-related proteins in the H9c2 cardiomyocytes induced by Ang II were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖5 Western blot檢測ASIV對Ang II誘導的心肌 H9c2細胞凋亡相關蛋白表達的影響

Figure 6.The effects of ASIV on ROS production in the H9c2 cells induced by Ang II (×200). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖6 ASIV對Ang II誘導心肌 H9c2細胞ROS生成的影響

4 ASIV對Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白表達的影響

Ang II組的Nrf2和HO-1蛋白表達較對照組呈明顯下降趨勢，Ang II+ASIV組則可上調Nrf2和HO-1蛋白表達(P<0.05)，且隨ASIV干預濃度不同呈劑量依賴性，見圖7。這一結果提示ASIV抑制心肌細胞凋亡的作用可能與Nrf2/HO1信號通路有關。

Figure 7.The effects of ASIV on the protein expression of Nrf2 and HO-1 in the H9c2 cells were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖7 Western blot檢測ASIV對Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

5 轉染后ASIV對ROS水平及Nrf2/HO-1信號通路的影響

為進一步驗證ASIV是通過調節(jié)Nrf2/HO-1信號通路而發(fā)揮作用，我們對H9c2細胞進行Nrf2-shRNA質粒轉染。轉染后干預顯示,與NC+control組相比，NC+AngⅡ組及shRNA+AngⅡ組ROS水平升高，Nrf2和HO-1 蛋白的表達水平降低(P<0.05)；與NC+AngⅡ組相比，NC+Ang II+ASIV組ROS水平降低，Nrf2和HO-1蛋白的表達水平升高(P<0.05)，shRNA+AngⅡ組及shRNA+AngⅡ+ASIV組ROS水平升高，Nrf2和HO-1蛋白的表達水平降低(P<0.05)，見圖8。這一結果提示ASIV是通過介導氧化應激，調節(jié)Nrf2/HO1信號通路而發(fā)揮細胞保護作用。

討 論

黃芪是一種傳統(tǒng)中藥，其有效成分ASIV具有強大的抗炎、抗纖維化、抗氧化應激、抗哮喘、抗糖尿病和免疫調節(jié)等多重藥理作用[7]。此外，ASIV還可逆轉心肌細胞肥大，抑制心肌纖維化，改善心室重塑，從而發(fā)揮保護心臟的作用，但其具體作用機制仍不夠明確。本研究利用Ang II誘導心肌H9c2細胞凋亡，發(fā)現ASIV對Ang II誘導的心肌H9c2細胞凋亡具有濃度依賴性的抑制作用，并進一步探討其對ROS水平及Nrf2/HO-1通路蛋白的影響，發(fā)現ASIV能降低Ang II誘導的ROS產生，上調Nrf2和HO-1的表達水平，且這一作用在Nrf2-shRNA轉染后被消除，表明ASIV可能通過降低ROS水平，并介導Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮細胞保護作用。

細胞凋亡是維持正常細胞更新及組織內穩(wěn)定的重要部分，是受損細胞死亡、正常細胞替代的運行機制，是一個活躍的、具有能量依賴性的細胞死亡機制[8]。心肌細胞凋亡導致的心肌細胞丟失是影響心臟結構和功能的重要因素，在HF的發(fā)展進程中占主導地位。心肌細胞凋亡參與了心肌肥厚大鼠模型的建立及HF患者的心肌損害發(fā)生[9]。有研究表明，在心臟肥大的進展過程中，心臟多由同心性肥大向偏心性肥大發(fā)展，導致心肌纖維化和心肌細胞凋亡，最終導致心力衰竭[10]。另有研究表明，心肌細胞凋亡與心肌成纖維細胞的活化及肌成纖維細胞的轉化導致心肌細胞的丟失，造成心功能惡化，最終導致心室重塑甚至心力衰竭[11]。Ang II是RAAS系統(tǒng)的主要介導者，其可通過引起血壓升高，從而影響心血管功能。此外，它還可以直接調節(jié)心肌細胞生理學，對心肌的收縮，心肌細胞的代謝，心肌細胞的凋亡及心肌的肥厚性生長均有明顯作用[12]。本研究通過Ang II誘導H9c2心肌細胞凋亡，結果表明ASIV可提高心肌 H9c2細胞活性，降低Ang II誘導的細胞凋亡率，下調促凋亡蛋白Bax的表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而發(fā)揮抗凋亡作用，這與以往的研究相一致。Mei等[4]通過構建大鼠心肌肥厚模型，驗證了ASIV可抑制心肌細胞凋亡，其機制可能為減輕氧化應激、降低calpain活性，及抑制calpain-1蛋白表達。Guan[13]等發(fā)現ASIV可抑制氧化應激導致的心肌細胞凋亡, 并進一步證實其與激活線粒體上ATP敏感性鉀通道及減輕心肌細胞內鈣超載相關。

Figure 8.The effects of ASIV on ROS level (A) and Nrf2/HO-1 signaling pathway (B) after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC+control group;&P<0.05vsNC+Ang II group;△P<0.05vsshRNA+control group;▲P<0.05vsNC+Ang II+ASIV group.

圖8 轉染后檢測ASIV對ROS水平及Nrf2/HO-1信號通路的影響

氧化應激被認為是心臟病發(fā)病機制的關鍵因素之一，參與了心肌肥厚、心肌重塑、糖尿病性心肌病甚至心力衰竭的發(fā)生及發(fā)展[14-15]，其中ROS水平的增加是誘導氧化應激損害的主要因素之一[16]。有研究表明，ROS是正常細胞有氧代謝的副產物，對維持細胞內信號轉導及機體內環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用，但過量的ROS將通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至壞死。在Ang II的介導的蛋白質、細胞器、DNA等細胞內結構的破壞過程中可見ROS的大量產生[17]。另有研究表明，Ang II可直接抑制心肌細胞存活機制，導致心肌細胞凋亡，并誘導ROS和轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)大量產生，最終誘導心肌纖維化[18-19]。本研究通過檢測Ang II對心肌細胞內ROS水平的影響，發(fā)現Ang II可誘導心肌細胞內ROS的產生，而ASIV可降低ROS水平，減輕氧化應激，從而發(fā)揮抗心肌細胞凋亡作用，這與既往研究結果相一致。既往有研究通過構建缺氧/復氧模型，發(fā)現ASIV可通過降低心肌細胞內ROS水平、上調心肌細胞Hes1蛋白表達而調控心肌細胞Notch1/Hes1信號通路，從而發(fā)揮對心肌細胞的保護作用[20]。

Nrf2是氧化還原穩(wěn)態(tài)和細胞抗氧化防御的關鍵調節(jié)因子，在內源及外源性應激下，通過與啟動子區(qū)ARE結合，調節(jié)抗氧化防御基因如HO-1的表達[21-22]。在動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病型心肌病等心血管疾病中，細胞氧化還原平衡被打破，Nrf2表現出高度敏感性[25]。另有研究通過構建心肌肥厚模型發(fā)現，Nrf2的介導抑制了Ang II誘導的心肌肥厚，進一步表明Nrf2/HO-1信號通路參與了心臟損傷的調控進程[24]。既往研究表明，細胞間過量產生的ROS誘導Nrf2的靶向抗氧化基因發(fā)揮保護作用；相反，Nrf2防御系統(tǒng)激活通過調節(jié)ROS和炎癥過程減輕氧化應激損傷[25-26]。另有研究表明，楊梅素可通過增強Nrf2和HO-1基因的表達對糖尿病心肌病具有潛在的保護作用，從而減輕氧化應激、炎癥、凋亡和纖維化[27]。此外，有研究證實，人參皂苷Rg1可通過激活Nrf2/HO-1信號通路來保護心肌細胞免受缺氧/復氧損傷，其作用與保護心肌細胞免受氧化應激損害相關[28]。ASIV作為一種抗氧化劑，已被證實在神經元中通過抑制ROS生成并激活Nrf2信號通路發(fā)揮作用，但在心肌細胞中作用機制尚不明確。本研究通過Ang II誘導心肌細胞凋亡，檢測Nrf2及其下游基因HO-1的蛋白表達，發(fā)現ASIV可抑制Ang II誘導心肌細胞中Nrf2及HO-1蛋白水平的下降，上調Nrf2和HO-1蛋白的表達，轉染后這一作用被消除，從而表明ASIV通過Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮心肌細胞保護作用。

綜上所述，我們通過對凋亡率的檢測、ROS水平、凋亡蛋白及Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達的研究，發(fā)現ASIV對Ang II誘導的心肌細胞凋亡具有抑制作用，其作用與降低ROS水平，減輕氧化應激，并介導Nrf2/HO-1信號通路相關。但本研究僅從心肌細胞株即H9c2細胞層面探討了ASIV對心肌細胞保護作用及其機制，仍需進一步從原代心肌細胞及大鼠體內進行探究，以期為ASIV對心血管疾病的保護作用提供新的理論依據，為ASIV在心血管疾病領域的應用開拓了更廣闊的前景。