路菲菲，王元松，呂樹泉，蘇秀海

(1. 河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院， 石家莊 050200； 2. 河北中醫(yī)學(xué)院附屬河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常見的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)最常見的病因[1]。早期腎臟病變具有可逆性，一旦進(jìn)入顯性蛋白尿期，其病變即為不可逆，患者不得不接受透析甚至腎移植治療，所以如何采取有效措施抑制DN的進(jìn)展成為目前的研究重點[2-3]。

前期臨床研究發(fā)現(xiàn),三黃益腎膠囊可明顯減少早期糖尿病腎病患者尿蛋白，改善患者癥狀[4]。動物實驗發(fā)現(xiàn),該中成藥可能通過影響TGF-β1、VEGF[5]、MMP-9、TNF-α[6]、NO、NOS[7]等在腎臟的表達(dá)，發(fā)揮對糖尿病腎病的保護(hù)作用。研究表明，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程[8]。本研究通過建立糖尿病腎病大鼠模型，旨在探討三黃益腎膠囊對IGF-1表達(dá)的影響及可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

三黃益腎膠囊組成:黃芪、西洋參、山藥、山茱萸、菟絲子、黃精、地黃、芡實、金櫻子、益母草、丹參、川芎、蒼術(shù)、赤芍、王不留行，為河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑(冀藥制字Z 20050795)；雷米普利片由昆山龍燈瑞迪制藥有限公司生產(chǎn)(批號H 20030725)。

1.2 動物

70只健康清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±50) g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(動物合格證號11401300065459)。

1.3 試劑和儀器

鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸鈉(美國sigma公司)；Trizol(Invitrogen)；氯仿、異丙醇、無水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；DEPC水(北京索萊寶科技有限公司)；TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green，天根生物科技有限公司)。顯微鏡、CMOS(日本奧林巴斯)；多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)；石蠟切片機(jī)(德國萊卡RM 2015)；離心機(jī)(德國Eppendorf-5430)；低溫冰箱(日本三洋MDF-382 E型)；恒溫水浴箱(江蘇太倉醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；生物分光光度計(Eppendorf)、羅氏活力型血糖儀(德國羅氏)。

1.4 方法

70只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)取10只大鼠作為正常對照組(NC)，余60只作為造模組。造模前禁食10 h，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg/kg(STZ臨用前溶于0.1 mmol/L，pH4.2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中)，NC組腹腔注射等容量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模組72 h后尾靜脈取血測血糖,血糖值≥16.65 mmol/L作為DN大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)[9]。穩(wěn)定1周后，從造模成功的54只大鼠中隨機(jī)抽取50只分為糖尿病腎病組(DN)、三黃益腎低劑量組(SL)、三黃益腎中劑量組(SM)、三黃益腎高劑量組(SH)、雷米普利組(RP)每組各10只。SL組、SM組、SH組大鼠分別給予三黃益腎膠囊0.4 g/kg/d、0.8 g/kg/d、1.6 g/kg/d灌胃，RP組大鼠給予雷米普利片0.5 mg/kg/d灌胃,NC組、DN組大鼠給予等劑量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃8周。觀察過程中，死亡10只，最終成功納入結(jié)果分析的為50只。

1.5 指標(biāo)檢測及方法

1.5.1 生化指標(biāo) 治療8周末將大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液，用3%戊巴比妥80 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。腹主動脈采血，采集血液后將大鼠處死，將采集血液在離心機(jī)上高速離心3000 r/min，持續(xù)15 min，收集上清液，采用全自動生化分析儀進(jìn)行血甘油三酯(TG)、血膽固醇(TC)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)檢測。24 h尿微量白蛋白水平的測定應(yīng)用免疫透射比濁法。

1.5.2 HE染色法觀察大鼠腎組織結(jié)構(gòu) 大鼠取血后摘取雙腎，并去除腎包膜、腎門結(jié)締組織，用生理鹽水洗凈后置于4%中性多聚甲醛液中固定，石蠟包埋、切片并行HE染色。具體步驟如下：二甲苯脫蠟(10’)→無水乙醇洗去二甲苯(1’×2次)→95%酒精(1’)→90%酒精(1’)→85%酒精(1’)→自來水洗(2’)→蘇木精染色(1-5’)→自來水洗(1’)→1%鹽酸酒精分化20 s→自來水洗(1’)→稀氨水(1%)反藍(lán)30 s→自來水或蒸餾水洗(1’)→伊紅染色(20 s-5 min)→自來水洗(30 s)→85%酒精脫水(20 s)→90%酒精脫水(30 s)→95%酒精(1’)→95%酒精(1’)→100%酒精(2’)→100%酒精(2’)→二甲苯(2’)→中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.3 免疫組化 采用免疫組化法檢測腎組織中IGF-1的表達(dá)：大鼠取血后摘取雙腎，并去除腎包膜、腎門結(jié)締組織，用生理鹽水洗凈后取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊；固定于4%多聚甲醛，經(jīng)70%乙醇30 min、80%乙醇30 min、90%乙醇30 min 2次，95%乙醇30 min 2次，100%乙醇30 min 2次，二甲苯透明30 min 2次，55 ℃石蠟中30 min 2次，用銅制模具包埋組織塊；將組織切片，厚度為3～5 μm，附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60 ℃烘烤過夜；將切片浸于二甲苯中5 min 2次，100%乙醇5 min 2次，95%乙醇5 min 2次，90%乙醇5 min 2次，85%乙醇5 min 2次，75%乙醇5 min 2次，自來水沖洗PBS洗 2次；1%甲醇雙氧水，室溫10 min，蒸餾水洗1次，0.1 MPBS洗3次×5 min；0.01 M檸檬酸鹽緩沖液中放入切片，在微波爐內(nèi)微波輻射10 min，待修復(fù)液降至室溫后，0.1 MPBS洗3次×5 min；切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體不洗；切片上滴加一抗，4 ℃過夜，0.1 MPBS洗3次×5 min；切片上滴加生物素化二抗(IgG)，37 ℃ 20 min，0.1 MPBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，0.1 MPBS洗3次×5 min；使用DAB顯色試劑盒1 ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻加到標(biāo)本上，顯色6 min后充分水洗；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min充分水洗，1%鹽酸酒精分化，1%胺水反藍(lán)充分水洗，經(jīng)70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2次，95%乙醇5 min 2次，100%乙醇5 min 2次脫水，二甲苯透明5 min 2次，中性樹脂封片；選擇對照組和實驗組的陰性和陽性組織相進(jìn)行顯微照相，倍數(shù)為400×。

IGF-1陽性表達(dá)為出現(xiàn)棕黃色顆粒，強(qiáng)度大于非特異性背景為準(zhǔn)。結(jié)果判斷參考文獻(xiàn)[10],按照染色深度和陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例進(jìn)行分級評分。A為陽性細(xì)胞數(shù)分級0～1%=0、1～10%=1、10～50%=2、50～80%=3、80～100%=4、B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強(qiáng)陽性)，IHS=A×B。

1.5.4 實時熒光定量PCR法檢測大鼠腎組織IGF-1mRNA的表達(dá) (1)提取樣本總RNA：用Trizol提取組織樣本中總RNA，步驟如下：用研缽研磨組織樣品，在加有1 ml Trizol的離心管中靜置5～10 min；加入0.2 ml氯仿進(jìn)行15～30 s的上下劇烈混勻，然后冰浴靜置3 min；4 ℃ 12000 rpm離心15 min；將水相加至新的EP管中，然后加入0.5 ml異丙醇使其混勻，冰浴10 min；4 ℃ 12000 rpm離心10 min；將上層液體倒出，用75%冰乙醇沉淀使其混勻，4 ℃ 12000 rpm離心5 min干燥。加入DEPC處理水使RNA溶解，然后檢測濃度，-80 ℃保存。

(2)反轉(zhuǎn)錄：采用TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行步驟操作，首先向反應(yīng)管中加入如下所示50 μL反應(yīng)體系的第一部分，使其混勻。試劑50 μL反應(yīng)體系，總RNA1 μg，Oligo(dT)2 μL，Super Pure dNTP2 μL，RNase-Free ddH2O定容至14.5 μL。然后70 ℃加熱5 min后，迅速在冰上冷卻2 min，簡短離心收集反應(yīng)液后加入如下所示的各組分：試劑50 μL反應(yīng)體系，混合物14.5 μL，5 xFirst-StrandBuffer0.5 μL，RNasin0.5 μL，TIANScrip M-MLV1 μL。輕輕吸打混勻后進(jìn)行10 min的25 ℃溫浴，50 min的42 ℃溫浴，然后用95 ℃的溫度加熱5 min。最后用RNase-Free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋至50 μL，-20 ℃保存。

(3)實時熒光定量PCR

引物設(shè)計

反應(yīng)體系：按照產(chǎn)品說明書操作實驗,試劑20 μL反應(yīng)體系,2*SuperReal PreMix Plus 10 μL,上游引物(10 μM) 0.6 μL,下游引物(10 μM) 0.6 μL,cDNA 100 ng,50*ROX Reference Dye△ 0.4 μL,RNase-Free ddH2O至20 μL。

反應(yīng)程序

結(jié)果分析:用熒光定量PCR儀，用2-△△Ct法進(jìn)行分析，參照正常對照組的目的基因表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)檢測結(jié)果

表1顯示，與NC組大鼠比較,DN組大鼠血糖、甘油三酯、膽固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白均升高(P<0.05)；與DN組大鼠比較,SM組、SH組、RP組大鼠肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠腎組織光鏡下變化

圖1顯示，NC組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球大小正常，未見腎小球基底膜增厚，也無系膜基質(zhì)增生，腎間質(zhì)無浸潤的炎性細(xì)胞；DN組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)混亂狀態(tài)，可見增大的腎小球體積和增生的系膜基質(zhì)，還可見一些空泡樣變性，其部位在部分腎小管上皮細(xì)胞上，腎間質(zhì)有浸潤的炎性細(xì)胞；與NC組大鼠比較，各造模組大鼠腎臟體積變大明顯，與DN組大鼠比較，各治療組大鼠腎臟體積略小于DN組大鼠腎臟體積。SM組、SH組大鼠的病理結(jié)構(gòu)改變相似，其病理改變程度均較DN組大鼠減輕，可見輕度肥大的腎小球、輕度增厚、增生的基底膜及系膜基質(zhì)腎間質(zhì)沒有明顯浸潤的炎性細(xì)胞；SL組大鼠病理改變較SM組、SH組大鼠重，腎小球、腎小管和腎間質(zhì)病變程度略優(yōu)于DN組大鼠。RP組大鼠腎小球未見明顯肥大，其結(jié)構(gòu)較清晰，未見明顯增生的系膜基質(zhì)，腎間質(zhì)未見明顯浸潤的炎性細(xì)胞。

2.3 免疫組化、實時熒光定量PCR法檢測腎組織IGF-1蛋白、基因表達(dá)

圖2表2顯示，IGF-1在腎小球、腎小管細(xì)胞中表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示,與NC組比較DN組IGF-1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，與DN組比較SM組、SH組、RP組表達(dá)減弱(P<0.05)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與NC組比較DN組IGF-1mRNA升高(P<0.05)，與DN組比較SL組、SM組、SH組、RP組降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠血糖、甘油三酯、膽固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白水平變化比較

注：與NC組比較：*P<0.05；與DN組比較：#P<0.05

圖1 各組大鼠腎組織病理改變(HE×400)

組別鼠數(shù)IGF-1IGF-1mRNANC60.15±0.061.13±0.22DN60.92±0.22?23.27±1.78?SL60.70±0.04?10.93±1.09?#SM60.50±0.02?#5.39±0.64?#SH60.48±0.06?#8.10±1.19?#RP60.43±0.04?#2.48±0.69?#

注：與NC組比較：*P<0.05；與DN組比較：#P<0.05

圖2 免疫組化法檢測各組大鼠腎組織IGF-1蛋白表達(dá)(×400)

3 討論

近年來，DN的發(fā)病率呈升高趨勢，我國約有20～40%的糖尿病患者并發(fā)此病[11]。DN的病理改變主要為腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積、系膜增寬、基底膜增厚，繼而發(fā)展為腎小球硬化病變。研究表明，IGF-1可以通過內(nèi)分泌、旁分泌等形式在細(xì)胞的分化、增殖、生長發(fā)育中發(fā)揮重要促進(jìn)作用[12-13]。IGF-1是一種能夠促進(jìn)細(xì)胞生長、具有胰島素樣代謝效應(yīng)的細(xì)胞因子，與DN病變密切相關(guān)。IGF-1有胰島素樣作用，能促進(jìn)葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)的運輸，使系膜細(xì)胞對葡萄糖的攝取增加，促進(jìn)系膜細(xì)胞的代償性增生，刺激系膜細(xì)胞合成蛋白而致細(xì)胞外基質(zhì)堆積，使腎小球硬化加速[14]。在高濃度葡萄糖環(huán)境下，IGF-1可以導(dǎo)致腎小球血流動力學(xué)改變[15]，一氧化氮(NO)在DN腎組織中血流動力學(xué)改變、細(xì)胞外基質(zhì)的形成起著重要作用，而IGF-1能促進(jìn)NO的產(chǎn)生。在DN中，高血糖可以導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞損傷，進(jìn)而使腎臟局部IGF-1旁分泌合成增多、降解減少，最終導(dǎo)致腎臟IGF-1水平升高[16]。由此可知，IGF-1在DN進(jìn)展中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，SM組、SH組大鼠腎組織中IGF-1蛋白及IGF-1mRNA較DN組降低，說明IGF-1可能是三黃益腎膠囊改善DN腎功能分子機(jī)制中的重要通路。

DN基本病機(jī)為本虛標(biāo)實，脾腎虧虛為本、血瘀為標(biāo)。三黃益腎膠囊以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀固精為主要功效，由黃芪、西洋參、山藥、山茱萸、菟絲子、黃精、地黃、芡實、金櫻子、益母草、丹參、川芎、蒼術(shù)、赤芍、王不留行組成，臨床觀察對早期DN療效肯定[17]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪有利尿、消除蛋白尿、保護(hù)腎小管的作用，黃精有提高機(jī)體免疫功能、抑制血糖過高、保護(hù)腎臟的作用，生地黃有強(qiáng)心、利尿、改善腎功能的作用，西洋參有抗疲勞、降血糖、抗利尿作用，山藥、山茱萸有降糖、抗氧化作用，益母草有利尿、改善腎功能作用，丹參有改善腎功能作用，川芎有改善微循環(huán)、抑制血小板凝集作用，王不留行有減輕氧化應(yīng)激作用，赤芍有改善早期腎功能作用，金櫻子、芡實有保護(hù)腎功能作用，菟絲子有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，蒼術(shù)有降糖等作用，諸藥聯(lián)用共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀固精之功。

本研究結(jié)果顯示，三黃益腎膠囊中、高劑量組能降低肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白水平，改善腎組織病理學(xué)變化，其機(jī)制可能與三黃益腎膠囊調(diào)節(jié)IGF-1表達(dá)，從而改善糖尿病腎病大鼠腎功能有關(guān)，此可能是三黃益腎膠囊治療DN的另一有效作用機(jī)制。