黃莉婷，王麗岳△，張博方，郭 鑫，陳 靜

(1. 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 武漢 430065； 2. 武漢市普仁醫(yī)院心內(nèi)科， 武漢 430081； 3. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430060)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，心血管疾病的患病率和死亡率持續(xù)升高，冠心病已逐漸成為世界范圍內(nèi)的主要致死原因[1]。目前臨床通過血運(yùn)重建改善心肌缺血性損傷的預(yù)后，已經(jīng)成為冠心病的主要治療手段，然而再灌注后，會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)等進(jìn)一步損傷[2]。大量研究表明，心肌缺血再灌注損傷可能與鈣超載、氧自由基增多、心肌纖維能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、酸中毒等機(jī)制有關(guān)[3]，但針對(duì)上述1種或幾種機(jī)制緩解再灌注損傷，目前還缺乏系統(tǒng)有效的治療方法。

近年來許多研究表明，黃酮類化合物在治療和預(yù)防心血管疾病中發(fā)揮著重要作用[4]，其中PI3K/Akt信號(hào)通路是參與保護(hù)心肌再灌注損傷的經(jīng)典通路之一[5]。研究證實(shí)，該通路能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡來對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷。佛手苷內(nèi)酯(BG：C12H8O4)作為一種黃酮類化合物，是天然的抗炎和抗氧化劑[6]。Daniela等發(fā)現(xiàn)，佛手苷內(nèi)酯能通過抑制腸道炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕腸缺血再灌注損傷[7]，但目前佛手苷內(nèi)酯對(duì)心肌缺血再灌注損傷治療的潛在效用還缺乏相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，模擬心肌缺血再灌注過程，研究佛手苷內(nèi)酯對(duì)心肌缺血再灌注損傷的作用。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。

1 材料

1.1 藥物與試劑

佛手苷內(nèi)酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基(Hyclone，USA)，胎牛血清(FBS，GIBICO，USA)，青-鏈霉素溶液(美國(guó)Hyclone)，0.25%胰酶溶液(Hyclone，USA)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma-Aldrich，USA)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，超氧化物歧化酶測(cè)試盒(Nanjing Jian Chen biotechnology)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)檢測(cè)試劑盒(Nanjing Jian Chen biotechnology)，乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(Nanjing Jian Chen biotechnology)，BCA檢測(cè)蛋白濃度試劑盒(Beyotime biotechnology)，丙二醛測(cè)試盒(ASPEN)， RIPA總蛋白裂解液(ASPEN)， 0.45 μm PVDF膜(Millipore)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(天津三箭生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡(Nikon Eclipse TS100，日本 Nikon 公司)，酶標(biāo)儀(Diatek公司)，流式儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)，轉(zhuǎn)移電泳儀槽(北京市六一儀器廠)，垂直電泳槽(北京市六一儀器廠)。

2 方法

2.1 H9C2細(xì)胞系傳代與培養(yǎng)

將武漢大學(xué)心血管病研究所長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)和規(guī)范凍存的H9C2心肌細(xì)胞按2×107cells密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清和1%的青-鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度到達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行傳代，每2～3 d用0.25%胰酶消化傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 缺氧復(fù)氧模型的構(gòu)建

向三氣培養(yǎng)箱中通入1% O25% CO2的混合氣體，當(dāng)氧氣濃度為1%時(shí)，將H9C2心肌細(xì)胞放入三氣培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)4 h， 4 h后停止通氣，取出心肌細(xì)胞更換為等體積的含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24 h。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將2 mg佛手苷內(nèi)酯(BG)溶于200μLDMSO，加入高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L。把H9C2心肌細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組。正常對(duì)照組(control 組)：加入適量正常培養(yǎng)液一直在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液；缺氧/復(fù)氧組(H/R組)：加入等量正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，缺氧4 h、復(fù)氧24 h； 5 μmol/L 佛手苷內(nèi)酯+缺氧/復(fù)氧組：(BG-5+H/R組)：用含5 μmol/L佛手柑內(nèi)酯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，缺氧4 h、復(fù)氧24 h；10 μmol/L 佛手苷內(nèi)酯組+缺氧復(fù)氧組(BG-10+H/R組)：用含10 μmol/L佛手苷內(nèi)酯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，缺氧4 h、復(fù)氧24 h；20 μmol/L 佛手苷內(nèi)酯+缺氧復(fù)氧組(BG-20+H/R組：用含20 μmol/L佛手苷內(nèi)酯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，缺氧4 h、復(fù)氧24 h。

2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性

將各組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱(37 ℃ 5% CO2)中培養(yǎng)24 h，正常組和模型組更換普通培養(yǎng)液，加藥組分別加入不同濃度含佛手苷內(nèi)酯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，各組做相應(yīng)處理后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于正常培養(yǎng)箱孵育4 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(A)值(檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm)。

2.5 細(xì)胞損傷釋放血清心肌酶檢測(cè)

復(fù)氧24 h后抽取各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，加入2 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液、基質(zhì)緩沖液和輔酶Ⅰ應(yīng)用液，混勻后置于37 ℃水浴鍋中靜置15 min，再加入2,4-二硝基苯肼混勻，水浴15 min，最后加入0.4 mol/L NaOH溶液室溫下放置3 min，用分光光度計(jì)于440 nm波長(zhǎng)測(cè)定各管吸光度，計(jì)算LDH活性。按照試劑盒方法，用自動(dòng)分光光度計(jì)檢測(cè)CKMB活性。

2.6 細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測(cè)

復(fù)氧24 h后抽取各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照丙二醛(MDA)試劑盒和超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)方法，用自動(dòng)分光光度儀檢測(cè)MDA、SOD活性。

2.7 細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)

復(fù)氧24 h后棄去各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞于流式管中，1500 rpm離心5 min去除上清液，用4 ℃預(yù)冷的PBS溶液洗滌2次，再次離心取細(xì)胞沉淀。按照Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明，各組均加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后避光孵育10 min，然后加入5 μL PI，混勻后避光孵育5 min，1h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，最后在流式二維圖中計(jì)算凋亡率。

2.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

將各組心肌細(xì)胞在含有50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L二硫蘇糖醇，1% Triton X-100和1% 蛋白酶抑制劑的裂解液中進(jìn)行勻漿。將勻漿物離心5 min(12 000×g，4 ℃)后取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE(10%分離膠，5% 濃縮膠) 電泳分離，經(jīng)濕轉(zhuǎn)80 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5% 脫脂牛奶封閉2 h，在4 ℃中將TNF-α抗體、IL-6抗體、PI3K抗體、p-PI3K抗體、Akt抗體、p-Akt抗體孵育過夜，用TBST 3×10 min洗膜后加入二抗(在室溫下孵育2 h)，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，以GADPH為內(nèi)參對(duì)照,采用Image-pro Plus處理軟件分析圖像信息。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 佛手苷內(nèi)酯對(duì)H/R心肌細(xì)胞活力的影響

表1顯示，與正常組比較，H/R組心肌細(xì)胞活性明顯下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而加入濃度為5、10、20 μmol/L的佛手苷內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞活性比H/R組明顯增加(P<0.05)，且隨著濃度升高細(xì)胞活性逐漸增加，表明佛手苷內(nèi)酯可顯著提高心肌細(xì)胞活性。

3.2 佛手苷內(nèi)酯對(duì)H/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

表1顯示，H/R損傷后相較于對(duì)照組，心肌細(xì)胞內(nèi)MDA活性升高，SOD水平下降。加藥組心肌細(xì)胞MDA活性明顯下降，SOD水平明顯升高，與H/R組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3 佛手苷內(nèi)酯對(duì)H/R心肌細(xì)胞LDH、CKMB漏出量的影響

表1顯示，心肌細(xì)胞缺氧4 h、復(fù)氧24 h后，心肌細(xì)胞內(nèi)心肌酶LDH、CKMB漏出量比正常組明顯增加。與H/R組比較，加藥組LDH、CKMB漏出量明顯減少(P<0.05)，且呈濃度依賴性。

表1 不同濃度佛手苷內(nèi)酯對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子及心肌細(xì)胞活性影響比較

注：與control組比較:*P<0.05；與HR組比較:#P<0.05；與BG-5+HR比較：&P<0.05

3.4 佛手苷內(nèi)酯對(duì)H/R心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖1顯示，缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞凋亡水平明顯提高，正常細(xì)胞明顯減少(P<0.05)；給予佛手苷內(nèi)酯(5、10、20 μmol/L)預(yù)處理后，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

注：與control組比較：*P<0.05;與HR組比較：#P<0.05;與BG-5+HR比較：&P<0.05圖1 不同濃度佛手苷內(nèi)脂對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡率影響比較

3.5 佛手苷內(nèi)酯對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后釋放炎癥因子的影響

圖2顯示，心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后，炎癥因子TNF-α、IL-6釋放相比正常組顯著增加，而加藥組則呈劑量依賴性抑制炎癥因子的釋放(P<0.05)。

3.6 佛手苷內(nèi)酯對(duì)H/R心肌細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)的影響

圖2顯示，各組心肌細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)量無明顯差異。與正常組比較，H/R組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)量顯著下降，5、10、20 μmol/L佛手苷內(nèi)酯處理組可顯著增加2種蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

注：與control組比較：*P<0.05;與HR組比較：#P<0.05;與BG-5+HR比較：&P<0.05圖2 不同濃度佛手苷內(nèi)酯對(duì)TNF-α(A)、IL-6(B)、p-PI3K(C)、p-Akt(D)蛋白水平影響比較

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過缺氧復(fù)氧處理模擬心肌細(xì)胞缺血再灌注過程，從細(xì)胞水平探討佛手苷內(nèi)酯對(duì)其保護(hù)作用及可能機(jī)制。

心肌細(xì)胞在缺血缺氧狀態(tài)下，清除氧自由基系統(tǒng)包括過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)等含量下降，氧自由基增多；血供恢復(fù)后，氧自由基進(jìn)一步爆發(fā)性增長(zhǎng)，加重對(duì)心肌細(xì)胞的損害[3,8]。同時(shí)丙二醛(MDA)含量升高，反映了氧自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化的情況[9]。本實(shí)驗(yàn)中，藥物處理組檢測(cè)SOD含量較模型組明顯升高，而MDA含量明顯降低，表明佛手苷內(nèi)酯能加強(qiáng)清除氧化自由基的能力，從而減輕氧自由基損傷。另外，心肌缺血損傷會(huì)引起細(xì)胞損傷并增加細(xì)胞膜和線粒體性膜通透性，使乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)等心肌酶釋放增多[10]。佛手苷內(nèi)酯能減少CK-MB、LDH的釋放，說明它能減輕細(xì)胞膜的損傷程度而發(fā)揮膜穩(wěn)定作用。心肌細(xì)胞膜損傷釋放大量炎性介質(zhì)，吸引中性粒細(xì)胞聚集，而進(jìn)一步堵塞血管加重?zé)o復(fù)流現(xiàn)象[11]。實(shí)驗(yàn)中，佛手苷內(nèi)酯通過顯著抑制白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等促炎因子的釋放來減輕炎癥反應(yīng)。

心肌缺血能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并在缺血及再灌注中產(chǎn)生大量氧自由基加快細(xì)胞凋亡過程，導(dǎo)致心肌損傷和心功能下降。本實(shí)驗(yàn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，提示0～10 μmol/L的佛手苷內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞活性逐漸增高，當(dāng)濃度在20 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性最高。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，隨著藥物濃度升高，細(xì)胞凋亡率呈下降趨勢(shì)，提示佛手苷內(nèi)酯對(duì)心肌細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，能夠抑制細(xì)胞凋亡，并且有濃度依賴性。

佛手柑是意大利南部的一種特產(chǎn)水果，主要用于生產(chǎn)精油，作為許多香水的成分，還可用于芳香療法。中藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，佛手柑有理氣化痰、治療心下氣痛、緩解胃痛、胸脅痛、嘔吐和抗癌的功效[12]。Bose等研究發(fā)現(xiàn)，麻黃根中的佛手苷內(nèi)酯能抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)2個(gè)炎癥因子的分泌[13]。Impellizzeri D等研究證明，佛手苷內(nèi)酯能抑制脂質(zhì)過氧化(MDA水平)，增加抗氧化劑含量，如MnSOD酶等氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)[14]。MingXia Zheng等在BG對(duì)脂多糖(LPS)介導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成、骨吸收和體外破骨細(xì)胞存活的影響研究中，發(fā)現(xiàn)BG能通過破骨細(xì)胞及其前體的凋亡反應(yīng)，有效地阻止LPS誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的發(fā)生、骨吸收和存活[15]。而XueJu Li等證實(shí)，BG能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt、JNK/MAPK和NF-κB信號(hào)通路保護(hù)骨小梁結(jié)構(gòu)，減少破骨分化，抑制糖尿病相關(guān)骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展[16]。結(jié)合上述研究及本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，佛手苷內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用，并可能與PI3K/Akt途徑有關(guān)。

PI3K是一類包含許多脂質(zhì)激酶的家族，由磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)的肌醇環(huán)第3位點(diǎn)碳原子磷酸化形成，可被受體酪氨酸激酶的配體激活。 Akt又名蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路下游的一個(gè)重要靶點(diǎn)。活化的PI3K催化Akt從胞膜釋放下來在胞質(zhì)內(nèi)繼續(xù)傳遞生物學(xué)信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖和代謝[17]。另外，通過減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的開放，調(diào)控線粒體產(chǎn)生能量，進(jìn)一步清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，抑制細(xì)胞凋亡，減少中性粒細(xì)胞的活化和聚集[18]。Okumura H等通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈構(gòu)建大鼠心肌I/R模型，發(fā)現(xiàn)急性期注射腎上腺髓質(zhì)素(AM)可明顯減輕再灌注損傷，并且依賴于PI3K/Akt途徑發(fā)揮保護(hù)作用，表明PI3K/Akt信號(hào)通路參與心肌再灌注損傷中的保護(hù)作用[19]。Zhao等也發(fā)現(xiàn)，二氧化硫預(yù)處理組大鼠心肌梗死面積相比對(duì)照組明顯縮小，心肌磷酸化Akt和PI3K明顯增多，且能被LY294002(PI3K抑制劑)阻斷，表明PI3K/Akt信號(hào)通路在心肌缺血再灌注中發(fā)揮重要作用[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，佛手苷內(nèi)酯能顯著提高PI3K和磷酸化Akt的表達(dá)量，與上述研究相符，表明佛手苷內(nèi)酯對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用與PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，佛手苷內(nèi)酯能通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡等作用保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，并與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。但心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，且涉及多種信號(hào)通路的作用。關(guān)于佛手苷內(nèi)酯具體如何影響PI3K/Akt信號(hào)通路，以及是否與其他通路存在相互作用，還有待于進(jìn)一步的深入研究。