胡欣俊，余東林，范 宏，韓改凈，薛 征，呂 湘

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 病理生理學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

輸血治療仍是目前臨床上不可替代的治療手段且用血量日益增長(zhǎng)。已有在體外液體培養(yǎng)基中，由造血干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成成熟紅細(xì)胞的技術(shù)，但其中干細(xì)胞體外分化效率低，分化細(xì)胞成熟度不夠，紅系終末分化和脫核效率低等問題都是困擾體外高效造血的限速步驟。

蛋白酪氨酸磷酸酶4A3(protein tyrosine phos-phatase type 4A member3,Ptp4a3)基因位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂(8q24.3)，由40 462個(gè)堿基對(duì)組成。PTP4A3蛋白共 173個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量19 535 ku，屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員。PTP4A3促進(jìn)小鼠胎肝來源紅系細(xì)胞脫核在細(xì)胞增殖[1]、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[2]及自噬等過程中均發(fā)揮重要作用。有報(bào)道PTP4A3促進(jìn)小鼠胎肝來源紅系細(xì)胞脫核可通過促進(jìn)有絲分裂G1期向S期轉(zhuǎn)換參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[3]。PTP4A3促進(jìn)小鼠胎肝來源紅系細(xì)胞脫核在小鼠紅系終末分化細(xì)胞中高表達(dá)，但其功能尚未明確。本工作初步探討并提示PTP4A3促進(jìn)小鼠胎肝來源紅系細(xì)胞脫核在紅系脫核中發(fā)揮重要調(diào)控功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞： C57 孕鼠取E 13.5 胎肝，磁珠分選Ter119陰性細(xì)胞；人胚腎上皮細(xì)胞系HEK-293T(ATCC細(xì)胞庫(kù)https://www.atcc.org)。

1.1.2 試劑：胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、細(xì)胞培養(yǎng)基IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、L-谷氨酰胺(L-glutamine)、血清替代物、PFHM-Ⅱ(Gibco公司) ；β-巰基乙醇、地塞米松、膽固醇、轉(zhuǎn)鐵蛋白(holo-transferrin)、MTG、HEPES(Sigma-Aldrich公司)；重組人胰島素(翎圣公司)；IL-3、EPO(Peprotech公司)；IGF-1、SCF(Stem Cell公司)；線性 PEI轉(zhuǎn)染試劑p4000(北京蘭博利德生物科技公司)。青霉素-鏈霉素抗生素、F108(Invitrogen公司)；Ter119磁珠(BD公司)；構(gòu)建質(zhì)粒所需的內(nèi)切酶(NEB公司)；SYBR Green PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建：構(gòu)建shRNA干擾質(zhì)粒，在Splashrna網(wǎng)站(http://splashrna.mskcc.org)設(shè)計(jì)shRNA，使用sh-Luc(Ctrl)作為對(duì)照組,sh-PTP4A3作為實(shí)驗(yàn)組。合成相應(yīng)干擾序列并在兩端加入KpnⅠ/XhoⅠ 酶切位點(diǎn)，95 ℃ 高溫退火，得到的雙鏈片段與線性化的 SFFV-GFP-mir30 載體連接，轉(zhuǎn)化后挑菌提質(zhì)粒，進(jìn)行病毒包裝。

1.2.2 病毒包裝體系：A液，20 μL P4000 +500 μL 0.9%氯化鈉溶液3；B液，PAX2 7.5 μg，pMD2.G 3.5 μg，干擾質(zhì)粒10 μg。A液配制完成后室溫靜置5 min，再與B液混合，二者混勻室溫靜置15 min后加于HEK-293T細(xì)胞中。

1.2.3 小鼠胎肝培養(yǎng)體系：胎肝細(xì)胞復(fù)蘇后前3 d使用增殖培養(yǎng)基，第4天更換分化培養(yǎng)基直至第7天。細(xì)胞濃度保持在約 2×106細(xì)胞/mL。

1.2.4 病毒包裝:48 h后收集病毒上清于50 mL離心管中，4 ℃ 3 000×g，離心15 min去除細(xì)胞碎片，0.45 μm濾膜過濾。病毒上清于無菌離心管中，超高速離心機(jī)，4 ℃ 50 000×g，離心4 h。病毒沉淀用DMEM培養(yǎng)基重懸(與病毒上清體積比為1∶100)。按細(xì)胞數(shù)加入病毒重懸液及HEPES和F108感染胎肝細(xì)胞，細(xì)胞置于恒溫37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞為2 × 105個(gè)/mL。

1.2.5 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)：細(xì)胞離心棄上清，BSA封閉30 min后，加入標(biāo)記抗鼠Ter119-PE抗體避光孵育60 min，PBS洗滌，加入hoechst避光孵育10 min。使用SONY MA900全自動(dòng)流式分選儀測(cè), 并用FlowJo V10軟件分析結(jié)果。

1.2.6 RT-qPCR：收取細(xì)胞后利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，檢測(cè)目標(biāo)基因在mRNA水平的表達(dá)情況。

1.2.8 生物信息學(xué)分析：對(duì)分選得到的小鼠胎肝細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序建庫(kù)并二代測(cè)序，測(cè)序文件(fastq格式)使用cutadapt和trimmomatic軟件去除接頭和低質(zhì)量序列，數(shù)據(jù)清洗后使用hisat2軟件比對(duì)到小鼠基因組mm10得到sam文件，使用samtools壓縮為bam文件后，使用featureCounts軟件得到基因表達(dá)矩陣(count文件)。進(jìn)一步使用deseq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析，使用pheatmap軟件可視化差異表達(dá)基因。

1.2.9 引物序列：短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)干擾序列及RT-qPCR引物序列見表1，2。

表1 shRNA干擾序列Table 1 Sequences for shRNA

表2 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 篩選紅系終末分化的潛在調(diào)節(jié)基因

根據(jù)小鼠紅系終末分化4個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析在此過程中平均表達(dá)水平在前100位且表達(dá)逐漸升高的基因。發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸磷酸酶PTP4A4在早幼紅(basophilic erythroblast, Baso)、中幼紅(polychromatic erythroblast, Poly)和晚幼紅(orthochromatic erythroblast, Ortho)細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)量逐步升高(圖1A)。PTP4A4是為數(shù)不多的在紅系分化晚期高表達(dá)的磷酸酶之一(圖1B)。在小鼠胎肝體外紅系分化體系中檢測(cè)Ptp4a3的表達(dá)，也證實(shí)PTP4A4隨紅系分化表達(dá)逐漸升高(圖1C)。

2.2 敲低Ptp4a3抑制紅系脫核

與對(duì)照細(xì)胞相比，兩條shRNA干擾序列均導(dǎo)致小鼠胎肝細(xì)胞中Ptp4a3mRNA表達(dá)水平顯著降低(圖2A)。與對(duì)照組相比，敲低Ptp4a3的表達(dá)導(dǎo)致胎肝來源紅系細(xì)胞中Ter119+Hoechst-無核紅細(xì)胞比例，即紅系脫核率，顯著降低(圖2B)(Ctrl: 25.3%±1.9%vssh-Ptp4a3-1: 14.4%±2.5%vssh-Ptp4a3-2: 16.9%±1.4%,n=3)，而沒有檢測(cè)到對(duì)紅系分化的明顯影響(圖2C)。

2.3 敲低Ptp4a影響細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)

在小鼠胎肝細(xì)胞中敲低Ptp4a3并誘導(dǎo)其向紅系分化，分選得到Ptp4a3敲低組與對(duì)照組有核紅細(xì)胞(Ter119+Hoechst+)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，主成分分析PCA(圖3A，左)和樣本聚類分析(圖3A，右)顯示樣本組內(nèi)重復(fù)較好且組間具有明顯的差異。進(jìn)一步進(jìn)行差異表達(dá)分析，共獲得4 430個(gè)表達(dá)變化2倍以上的差異基因，其中上調(diào)基因1 718個(gè)，下調(diào)基因2 712個(gè)(圖3B，C)。下調(diào)差異基因中包括Ptp4a3，表明其敲低成功。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析(圖3D)， 結(jié)果顯示敲低Ptp4a3后表達(dá)上調(diào)的基因富集細(xì)胞周期、PI3K-AKT信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相關(guān)通路，下調(diào)基因中未富集到已知與紅系脫核相關(guān)的調(diào)控通路。

A.genes with top100 ranked and a gradually increased expression during mouse terminal erythroid differentiation were displayed by heat map;B.heat map of phosphatases expression during mouse terminal erythroid differentiation;C.RT-qPCR indicated the gradually increased Ptp4a3 expression during in vitro erythroid differentiation of mouse fetal liver

A.RT-qPCR indicated that Ptp4a3 was successfully knocked down in mouse fetal liver-derived erythroid cells, *P<0.001 compared with sh-LUC; B.flow cytometry analysis showed that knockdown of Ptp4a3 expression resulted in significant decrease in the ratio of erythroid enucleation,*P<0.05 compared with sh-LUC; C.knockdown Ptp4a3 did not affect erythroid differentiation

A.PCA plot and sample distance matrix plot;B.volcano plot of differential expression genes from Ptp4a3 knockdown fetal liver-derived erythroid cells compared to Ctrl cells;C.heatmap of all differentially expressed genes, the color indicated the scaled expression level;D.KEGG enrichment analysis of upregulated genes

3 討論

本研究首先利用實(shí)驗(yàn)室前期工作中小鼠紅系終末分化4個(gè)時(shí)期細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選在紅系終末分化中可能發(fā)揮功能的基因。分析結(jié)果顯示在紅系分化晚期高表達(dá)的基因包括HBb、Alas2、Rbm38和Ptp4a3等。其中β-珠蛋白作為血紅蛋白亞基，在紅系終末分化晚期大量積累是紅系分化晚期特征基因[4]，Alas2是成紅細(xì)胞中負(fù)責(zé)血紅素合成的關(guān)鍵基因，其突變與 X 連鎖鐵粒幼細(xì)胞性貧血有關(guān)[5]，此外Rbm38是紅系生成中可變剪接的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6-7]。本工作聚焦研究同樣在紅系終末分化晚期高表達(dá)的PTP4A3在紅系終末分化及脫核中的功能。通過慢病毒感染敲低Ptp4a3會(huì)導(dǎo)致小鼠胎肝細(xì)胞來源紅系細(xì)胞脫核率顯著降低。RNA表達(dá)譜分析提示，Ptp4a3可能通過影響細(xì)胞周期相關(guān)基因或PI3K-AKT通路參與調(diào)節(jié)紅系細(xì)胞脫核。已有研究發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 通路在紅系細(xì)胞脫核過程中通過重新定位細(xì)胞核促進(jìn)細(xì)胞極化及脫核[8]。

紅系分化與成熟對(duì)生命體至關(guān)重要，已有研究表明細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞分裂[9]、組蛋白釋放[10]等生物學(xué)過程與脫核密切相關(guān)。但蛋白磷酸酶在紅系脫核中的功能尚不清楚。 PTP4A3屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，包含一個(gè)酪氨酸磷酸化結(jié)構(gòu)域，并具有雙重磷酸酶活性，可對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸、蘇氨酸及絲氨酸位點(diǎn)去磷酸化，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和促進(jìn)有絲分裂過程中G1期向S期的轉(zhuǎn)換等功能。研究表明細(xì)胞周期改變?cè)诩t系分化多個(gè)階段發(fā)揮重要調(diào)控作用，在紅系分化早期通過促進(jìn)細(xì)胞從G1向S期轉(zhuǎn)變促進(jìn)細(xì)胞增殖，而細(xì)胞周期的退出在紅系終末分化中起重要作用[11-12]。表明PTP4A3參與調(diào)控紅系細(xì)胞脫核，但是否通過其磷酸酶功能發(fā)揮作用以及具體的分子機(jī)制仍需更深入研究。