鄧加雄,王香,李桂成,李云峰
(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,郴州 423000)
急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是臨床上常見的危重癥,由于其治療藥物相對缺乏,具有極高的死亡率[1-3],因此研究緩解ALI的有效藥物具有重要的臨床意義。虎杖苷是從中藥虎杖的根莖中提取的單體,在抗休克、炎癥及治療燒傷方面有顯著作用[1,2,4]。我們的前期研究表明[5],虎杖苷可以減輕脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介導(dǎo)的ALI中細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng),但機制并不明確。另有研究表明,線粒體損傷是ALI發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié),抑制線粒體損傷可以減輕ALI發(fā)病[6,7]。而虎杖苷可以通過激活沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶3(silent information regulator 2 related enzyme 3,SIRT3)保護線粒體,從而減輕失血性休克導(dǎo)致的腸損傷[4]。我們假設(shè)虎杖苷可通過SIRT3抑制線粒體損傷改善ALI,并通過LPS刺激A549細(xì)胞模擬ALI的體外實驗加以驗證,探討虎杖苷對LPS介導(dǎo)的線粒體損傷的影響,并進一步分析SIRT3在其中的可能作用。
熒光素-熒光素酶試劑盒購自美國Promega公司;線粒體膜電位JC-1探針及鈣黃綠素-氯化鈷購自美國Sigma公司;DCFH-DA活性氧(reactive oxygen species,ROS)熒光探針購自上海碧云天公司;細(xì)胞計數(shù)試劑盒 (cell count kit-8,CCK-8)購自上海Dojindo公司;SIRT3單克隆抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國ABclonal公司;A549細(xì)胞購自廣州賽庫生物公司。
將A549細(xì)胞分為4組(n=6):對照組為細(xì)胞僅接受0.1% DMSO處理7 h;模型組為細(xì)胞給予DMSO預(yù)處理,1 h后與LPS(5 mg/L)[3]共孵育6 h;治療組為細(xì)胞接受虎杖苷(50 μmol/L)[8]預(yù)處理,1 h后與LPS(5 mg/L)共孵育6 h;抑制劑組為細(xì)胞接受SIRT3抑制劑(50 μmol/L 3-TYP)[9]及虎杖苷50 μmol/L預(yù)處理,1 h后與LPS(5 mg/L)共孵育6 h。
在96孔板中接種200 μl的細(xì)胞懸液,根據(jù)實驗分組,細(xì)胞經(jīng)過不同條件處理后棄上清,加入10 μl的CCK-8溶液及培養(yǎng)液,繼續(xù)孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測A450 nm值,并以對照組進行標(biāo)準(zhǔn)化。
采用熒光素-熒光素酶法檢測線粒體腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)水平。將細(xì)胞懸液加入96 孔白板,每孔100 μl(約2×104個細(xì)胞)。于室溫下加入等體積的CellTiter-Glo 檢測試劑,混勻細(xì)胞,并孵育10 min,用Spectra Max M5酶標(biāo)儀檢測熒光強度,并以對照組標(biāo)準(zhǔn)化。
通過鈣黃綠素-氯化鈷檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondria permeability transition pore,mPTP)狀態(tài)。各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后,加入1 ml(濃度為1 μmol/L)染色工作液,并混合均勻,在37℃振蕩器中孵育10 min后,用Spectra Max M5酶標(biāo)儀檢測熒光強度(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm)。熒光強度下降表明mPTP開放,熒光強度增加表明mPTP開放被抑制。
采用DCFH-DA ROS熒光探針檢測細(xì)胞ROS水平。各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后與5 μmol/L濃度的DCFH-DA工作液在37℃下共孵育10 min,酶標(biāo)儀檢測熒光強度,并且在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光,并以對照組標(biāo)準(zhǔn)化。
各組細(xì)胞處理后經(jīng)PBS緩沖液洗滌,重懸,與熒光探針JC-1(工作濃度5 μmol/L)在37℃孵育15 min后共聚焦顯微鏡下觀察。以紅色與綠色熒光的比值來衡量線粒體去極化的程度,并以對照組進行標(biāo)準(zhǔn)化。比值越高表明線粒體去極化降低,線粒體膜電位(mitochondria membrance potential,MMP)增加,反之則去極化增加,膜電位下降。
Western blotting檢測SIRT3表達水平。各組細(xì)胞充分裂解,凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的灰度值比值表示目的蛋白相對表達量,并以對照組進行標(biāo)準(zhǔn)化。
與對照組比較,模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞中ATP、細(xì)胞活性及鈣黃綠素?zé)晒饩@著下降 (P<0.05);與模型組比較,治療組細(xì)胞上述指標(biāo)均顯著增加(P<0.05);與治療組比較,抑制劑組細(xì)胞上述指標(biāo)又顯著下降(P<0.05;表1)。
表1 4組細(xì)胞ATP水平、細(xì)胞活性及鈣黃綠素?zé)晒鈴姸缺容^
Table 1 Comparison of ATP level, cell activity and calcein fluorescence intensity among four groups (n=6,
ATP: adenosine triphosphate; mPTP: mitochondria permeability transition pore. Compared with control group,*P<0.05; compared with modol group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.
與對照組(100.0±6.3)%比較,模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞ROS水平均顯著增加(P<0.05),依次為(218.0±21.7)%、(180.0±18.1)%和(212.2±18.2)%。與模型組比較,治療組ROS水平顯著下降(P=0.001);與治療組比較,抑制劑組ROS水平又顯著增加(P=0.003;圖1)。
與對照組[(100.0±7.2)%]比較,模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞MMP均顯著下降(P<0.001),依次為(54.0±6.5)%、(75.8±7.6)%和(62.8±6.2)%;與模型組比較,治療組細(xì)胞MMP顯著增加;與治療組比較,抑制劑組細(xì)胞MMP又顯著下降 (P=0.004;圖2)。
圖1 DCHF-DA法檢測4組細(xì)胞ROS水平
圖2 JC-1法檢測4組細(xì)胞MMP變化
與對照組(100.0±11.8)%比較,模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞SIRT3表達顯著下降(P<0.05),依次為(73.3±4.5)%、(86.7±7.6)%和(69.0±7.8)%;與模型組比較,治療組SIRT3表達顯著增加;與治療組比較,抑制劑組SIRT3表達又顯著下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;圖3)。
圖3 Western blotting檢測4組細(xì)胞SIRT3表達
ALI是創(chuàng)傷、感染等臨床危重癥的常見并發(fā)癥之一,具有非常高的死亡率,因此一直是臨床工作中的棘手問題[3]。我們前期研究證實,虎杖苷可以通過抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)減輕LPS介導(dǎo)的ALI,但機制尚未明確[5]。線粒體是普遍存在于真核生物的細(xì)胞器,因生命活動所需的絕大多數(shù)能量都依賴于線粒體的合成,因此有細(xì)胞的“動力工廠”之稱。不僅如此,線粒體還在自由基形成、細(xì)胞信息傳遞、中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及內(nèi)源性凋亡途徑的啟動調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[10,11]。研究證實,肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷是ALI的重要發(fā)病機制,線粒體可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)參與ALI[6,12]。而大量研究證實,虎杖苷可以通過抑制線粒體損傷,在抗休克及抗炎癥中發(fā)揮作用[1,13]。因此,本研究中探討了虎杖苷對肺泡上皮細(xì)胞線粒體的影響。
線粒體功能不全通常是由mPTP開放引起[14]。在病理情況下,mPTP激活開放,允許<1.5 ku的小分子物質(zhì)自由出入,此時線粒體內(nèi)外的電荷梯度減小,線粒體跨膜電位降低;另外電子傳遞鏈復(fù)合酶質(zhì)子泵功能發(fā)生障礙時,H+泵入線粒體膜間隙不足同樣也會引起線粒體跨膜電位降低[13,15]。在本研究中,我們通過鈣黃綠素-氯化鈷檢測mPTP開放情況及膜電位去極化現(xiàn)象。正常情況下,鈷離子不能穿透線粒體膜,但在mPTP開放時,鈷離子可以自由進入線粒體,淬滅線粒體內(nèi)的鈣黃綠素?zé)晒?。我們的結(jié)果顯示,LPS刺激導(dǎo)致細(xì)胞鈣黃綠素?zé)晒鉁p弱,提示mPTP開放,而虎杖苷可以抑制LPS介導(dǎo)的mPTP開放。膜電位是維持線粒體正常功能的電位,正常線粒體是處于電壓內(nèi)負(fù)外正的極化狀態(tài),是由質(zhì)子泵將H+由內(nèi)膜泵出到膜間隙所致,但在mPTP開放時,因為小分子物質(zhì)(如H+)可以自由出入線粒體,使線粒體內(nèi)外的電荷梯度減小,跨膜電位降低[16]。我們的研究結(jié)果顯示,虎杖苷可以顯著抑制LPS介導(dǎo)的線粒體膜電位下降,這也與我們起初的假設(shè)是一致的。其次,線粒體是ATP生成的主要細(xì)胞器,本研究檢測了細(xì)胞的ATP水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激后的細(xì)胞ATP水平顯著下降,而虎杖苷可以使細(xì)胞內(nèi)ATP水平得到顯著恢復(fù),提示虎杖苷可以緩解線粒體損傷。再者,當(dāng)線粒體損傷,電子傳遞鏈發(fā)生障礙后,線粒體生成ROS增多,此時堆積的ROS將線粒體DNA及mPTP作為靶點,反過來加重線粒體損傷。由此我們又檢測了細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)虎杖苷同樣可以抑制LPS介導(dǎo)的ROS生成增加?;谝陨辖Y(jié)果,本研究認(rèn)為虎杖苷可以顯著改善LPS介導(dǎo)的線粒體功能障礙。進一步地,我們探討了虎杖苷減輕線粒體損傷的可能機制。
SIRT3是線粒體主要的去乙?;福赏ㄟ^調(diào)節(jié)線粒體代謝關(guān)鍵酶的乙酰化水平,參與線粒體代謝及生成等,因此調(diào)控SIRT3可能作為治療線粒體損傷的作用靶點[17,18]。本課題組既往研究證實,大鼠休克后,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達下調(diào),但上調(diào)SIRT3可以促進細(xì)胞自噬,抑制內(nèi)皮細(xì)胞線粒體凋亡信號的激活[9]。同時SIRT3也可以通過修飾呼吸鏈復(fù)合體減輕線粒體損傷[19]。本次研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞SIRT3表達顯著下降,而虎杖苷可以顯著提高SIRT3水平表達。研究證實,休克后線粒體錳超氧化物歧化酶(SOD2)乙酰化水平增加,導(dǎo)致線粒體ROS清除能力下降,而虎杖苷可以通過激活SIRT3,提高SOD2去乙酰化,清除ROS,發(fā)揮線粒體保護作用,從而改善失血性休克中的小腸損傷[4]。也有研究表明,虎杖苷可以通過SIRT1調(diào)節(jié)SOD2乙?;揎棧种凭€粒體損傷,減輕失血性休克中肝細(xì)胞損傷[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT3抑制劑3-YTP可以逆轉(zhuǎn)虎杖苷對線粒體的保護作用,提示虎杖苷可能通過激活SIRT3改善了LPS介導(dǎo)的線粒體功能障礙,但關(guān)于虎杖苷上調(diào)SIRT3的機制尚需進一步研究。
綜上,虎杖苷可以顯著改善LPS介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞線粒體功能障礙,而這有可能與虎杖苷激活SIRT3有關(guān)。