柯少波 石 薇 陳佳梅 邱 虎 陳永順

肝癌是全球最為常見的惡性腫瘤之一，在我國大多數(shù)患者是由肝硬化和慢性肝炎進一步發(fā)展而來[1]。手術治療仍是目前最為有效的治療手段，但復發(fā)率較高已經(jīng)供肝缺乏[2]。肝癌的基因治療主要通過調(diào)控腫瘤細胞遺傳物質(zhì)達到有效的抗腫瘤作用[3]。SMARCC1蛋白是染色體重塑復合體亞基的主要成員之一[4]，多項研究表明其參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沉默SMARCC1能抑制乳腺癌細胞的生物學活性，抑制腫瘤的侵襲轉移[7]。本研究擬通過下調(diào)肝癌細胞SMARCC1基因，探討SMARCC1對乳腺癌增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與細胞培養(yǎng)

肝癌細胞HepG2系購自武漢大學細胞典藏中心，低糖DMEM培養(yǎng)基、血清、胰蛋白酶等均購自武漢愛生源生物有限公司，Trizol和Lipofectamine2000為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，SMARCC1-siRNA及其對照物購自廣州銳博生物公司，細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、MTT試劑、等耗材均購自武漢谷歌生物公司，凋亡試劑盒購自碧云天公司。

1.2 實驗分組與轉染

肝癌細胞HepG2采用低糖DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清和1%雙抗)培養(yǎng)，置于37 ℃、5%二氧化碳及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為研究下調(diào)SMARCC1對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡和蛋白表達的影響，本實驗將細胞系分為兩組，SMARCC1下調(diào)組(轉染SMARCC1-siRNA)和 對照組(轉染siRNA陰性對照物)，將細胞置于六孔板中培養(yǎng)，當細胞融合程度達到70%左右時進行瞬時轉染，轉染操作按照廣州銳博公司產(chǎn)品說明書進行，轉染試劑采用Lipofectamine 2000，轉染最終濃度為50 nmol/L。

1.3 MTT檢測細胞增殖

轉染24小時后，將細胞以每孔3000個細胞接種于96孔板中，每孔細胞懸浮液的體積為100 μl，分為實驗組和對照組，每組設置5個復孔，并設置空白對照孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后采用MTT法檢測細胞增殖。MTT檢測方法概括為：在96孔板的每孔中加入10 μl的5 mg/L的MTT溶液， 37 ℃條件下放置下4 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入150 μl的DMSO溶液，孵育10 min，置于振蕩器上微震蕩15 min，使得甲瓚結晶充分溶解于DMSO中，采用酶標儀檢測各組的吸光度值(OD值)，通過空白對照孔調(diào)零。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

流式細胞儀檢測細胞凋亡：轉染48 h后，收集細胞約1×106個/ml，PBS洗滌一次、離心、棄上清，然后將細胞懸浮液重懸于1 ml孵育緩沖液中。取100 μl細胞(約1×105個)加5 μl的PI試劑和5 μl的AnnexinV-FITC試劑，置于室溫下避光孵育15 min。最后加400 μl的孵育緩沖液，一般在1 h內(nèi)上流式細胞儀機檢測。FCM激發(fā)波長為488 nm，采用波長515 nm的通帶濾器檢測FITC的熒光，另一波長>560 nm的濾器檢測PI。

1.5 RT-PCR檢測mRNA表達

Trizol法提取細胞的總RNA，檢測RNA濃度和純度是否達標，然后按照TagMan RNA逆轉錄試劑盒(購自美國ABI公司)說明書進行逆轉錄，獲得cDNA。采用SYBR Green PCR master mix試劑盒(購自日本TAKARA公司)進行qRT-PCR。采用2-△△方法進行定量分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算caspase-3、Bcl-2，相對表達量。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白。配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，加樣，電泳，濃縮膠80 V電泳35 min，分離膠100 V電泳90 min，分離蛋白，注意設置marker蛋白。采用濕轉發(fā)進行轉膜，350 mA，轉膜120 min，將蛋白轉至PVDF膜上。然后進行免疫雜交操作。取出PVDF膜，用BSA封閉1小時，兔抗人一抗孵育過夜(4 ℃條件下)，caspase-3 抗體購自武漢三鷹公司，稀釋比為1∶1 000，Bcl-2一抗購自Abcam公司，抗體稀釋比為1∶1 000，Actin一抗購自三鷹公司抗體稀釋比為1∶3 000；TBST系膜3次，每次5 min，二抗(山羊抗兔)孵育1 h，二抗為HRP標記山羊抗兔 IgG，購自三鷹公司，抗體稀釋比為1∶5 000，TBST洗膜，每次5 min，化學發(fā)光法顯影，在暗室中進行曝光操作，掃描膠片上蛋白條帶并用軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 下調(diào)SMARCC1對HepG2細胞增殖及凋亡作用

MTT實驗結果表明，轉染后24 h，48 h和72 h SMARCC1下調(diào)組的HepG2細胞增殖均低于對照組(P<0.05)，且隨著時間增加，SMARCC1下調(diào)組的MC F-7細胞增殖被抑制程度越大，具有時間依賴性，見圖1。Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡結果表明，SMARCC1下調(diào)組晚期凋亡率(7.3±0.9)%高于對照組晚期凋亡率(1.3±0.1)%，P<0.01。

2.2 兩組細胞Caspase-3、Bcl-2 的mRNA表達水平比較

RT-PCR實驗結果表明，實驗組 Caspase-3的mRNA相對表達量高于對照組，實驗組Bcl-2mRNA相對表達量低于對照組，均差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

圖1 MTT實驗結果

組別Caspase-3Bcl-2對照組0.257±0.0680.724±0.055實驗組0.452±0.0760.306±0.072t8.3659.749P<0.01<0.01

2.3 兩組細胞Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達水平比較

Western blotting實驗結果表明，實驗組 Caspase-3蛋白表達相對灰度值比高于對照組，實驗組Bcl-2蛋白表達相對灰度值比低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義，見表2和圖2。

表2 兩組細胞Caspase-3、Bcl-2蛋白灰度值比較

圖2 兩組細胞蛋白條帶圖

3 討論

核小體染色質(zhì)重塑復合體主要通過改變?nèi)旧|(zhì)空間結構而調(diào)控其疏松程度，從而調(diào)控下游基因的轉錄表達和細胞表型等過程，是表觀遺傳學的重要機制之一[8-9]。SWI/SNF復合體及其介導的核小體染色質(zhì)重塑已經(jīng)是腫瘤研究的焦點，SWI/SNF亞基基因在卵巢癌[10]、胃癌[11]、肝細胞癌[12]、膀胱癌[13]、腎癌[14]、乳腺癌等腫瘤中高度突變，參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展，可能是1種普遍癌癥發(fā)生機制。SWI/SNF復合體的核心亞基之一SNF5在人和小鼠中表現(xiàn)為一種抑癌基因，SNF5在肝癌組織中表達低于癌旁組織，其表達量與肝癌細胞分化程度有關，SNF5在肝細胞肝癌中呈現(xiàn)為低表達，并且其低表達與肝細胞肝癌的低分化程度顯著相關。SMARCC1是SWI/SNF復合體的亞基之一，本研究下調(diào)肝癌細胞系的SMARCC1基因，MTT和凋亡實驗結果表明，下調(diào)SMARCC1抑制了肝癌細胞的增殖，促進其凋亡。研究表明SMARCC1在乳腺癌、前列腺癌等中均呈現(xiàn)高表達，且細胞實驗表明內(nèi)源性的高表達促進了腫瘤細胞的增殖和侵襲，因此，SMARCC1可能是1種癌基因[15]。 另有研究者表明，SMARCC1在前列腺癌組織中呈現(xiàn)高表達，SMARCC1的表達高低與前列腺癌復發(fā)、淋巴轉移及病理Gleason分級呈正相關[16]。

為進一步探討下調(diào)SMARCC1而促進肝癌細胞HepG2凋亡的機制，本研究采用RT-PCR法及Western blotting 法檢測實驗組和對照組細胞增殖相關基因caspase-3和Bcl-2基因的蛋白和mRNA表達水平變化，結果表明，SMARCC1下調(diào)組細胞caspase-3的蛋白和mRNA表達水平均高于對照組，而SMARCC1下調(diào)組細胞Bcl-2的蛋白和mRNA表達水平均低于對照組。Caspase-3是caspase家族的重要成員之一，是1種蛋白酶，活化的caspase-3能促進腫瘤細胞凋亡，在惡性腫瘤細胞凋亡中起著不可替代的作用。caspase-3參與腫瘤細胞凋亡機制之一主要是誘導CTL細胞殺傷，本研究SMARCC1下調(diào)組的肝癌細胞caspase-3表達增加，說明下調(diào)SMARCC1后可能通過上調(diào)caspase-3基因表達而促進肝癌細胞的凋亡。B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)同樣是細胞凋亡研究中最受關注的基因之一，Bcl-2是重要的癌基因，能夠與其家族的Bcl-X1、Bcl-Xs、Bax等結合，形成同源的蛋白二聚體，抑制腫瘤細胞凋亡。在Bcl-2與Bax形成的二聚體中，如果Bax相對量高于Bcl-2，則促進腫瘤細胞凋亡，而Bcl-2若高于Bax則抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。本實驗中下調(diào)SMARCC1后Bcl-2基因表達水平被抑制，說明下調(diào)SMARCC1基因可能通過抑制癌基因Bcl-2而抑制腫瘤細胞增殖活性。

總之，下調(diào)SMARCC1基因能抑制腫瘤細胞增殖活性，促進其凋亡，其機制可能與活化caspase-3蛋白及抑制癌基因Bcl-2等通路相關。