林志堅 肖 斌 孫朝暉 李林海

根據(jù)2017 年發(fā)布的中國腫瘤登記年報顯示，乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)高居全球女性惡性腫瘤之首，發(fā)病率高達28.42/10 萬，每年新發(fā)病例約27.9 萬，死亡病例數(shù)約6.5 萬[1]。

谷氨酸是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，谷氨酸通過與谷氨酸受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用[2]。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體兩類。代謝型谷氨酸受體包括GRM1-8共8個受體亞型，為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，通過介導(dǎo)第二信使來調(diào)節(jié)受體生理功能[3]。

代謝型谷氨酸受體4 (Glutamate Metabotropic Receptor 4，GRM4)是1種突觸前谷氨酸受體，其在控制運動的基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路的數(shù)個關(guān)鍵位置表達[4]，參與突觸前興奮性谷氨酸信號的神經(jīng)傳遞。研究表明GRM4在結(jié)直腸癌[5]、骨肉瘤[6]等多種腫瘤中高表達并與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)，其過表達可能是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。而我們課題組近期也報道了GRM4與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)作用[7]。本研究擬構(gòu)建人GRM4基因慢病毒載體，并篩選穩(wěn)定表達GRM4蛋白的乳腺癌MDA-MB-231細胞株，為進一步探討GRM4在乳腺癌中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

非病毒質(zhì)粒3×Flag-GRM4、293T細胞系、MDA-MB-231細胞、慢病毒載體質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒pMD2.G及包裝質(zhì)粒psPAX2由本實驗室保存；DNA maker購自Takara公司(Cat:3427Q)；總RNA提取試劑(Cat:ER101-01)及qPCR試劑(Cat:AQ141-01)購自北京全式金公司；LipofectamineTM 2000購自Thermo Fisher(Cat:11668027)；凝膠純化試劑盒、TaqDNA聚合酶及dNTP、限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；ECL Western blotting試劑盒購自Thermo Fisher(Cat:WP20005)；DAPI染液購自碧云天(Cat:C1002)。

1.2 重組慢病毒GRM4質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

1.2.1 目的片段獲取 以之前構(gòu)建好的非病毒質(zhì)粒3×Flag-GRM4為模板，進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠純化后回收備用。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將PCR產(chǎn)物與慢病毒載體進行常規(guī)的連接、轉(zhuǎn)化、挑菌等分子克隆實驗，重組質(zhì)粒并送華大基因測序鑒定。

1.3 GRM4慢病毒的包裝

轉(zhuǎn)染前一天在10 cm平皿中接種293T包裝細胞，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；包裝細胞50%融合時共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2以及慢病毒表達載體各4 μg，以及30 μl標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000，同時設(shè)置慢病毒空載體pCDH-vector作為陰性對照；6 h后換液，加入10 ml的新鮮培養(yǎng)基；48 h后培養(yǎng)上清用0.45 μm的非硝酸纖維濾器消毒過濾，以清除細胞碎屑及污染的包裝細胞，4 ℃暫時保存。

1.4 MDA-MB-231細胞感染、穩(wěn)定株的與鑒定

感染前一天(18～24 h)，將目標(biāo)細胞鋪于10 cm平皿；細胞達到50%融合度后，將10 ml的含病毒上清液加入8 μg/ml的Polybrene(已配成1000×工作液)；6 h后更換正常培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM)；24 h后開始用濃度0.5 μg/ml puro篩選；每1～2天更換培養(yǎng)基(均含相同puro濃度，根據(jù)細胞死亡情況，調(diào)整puro濃度)；約1周后可挑選出穩(wěn)定細胞株，獲得的細胞即為穩(wěn)定表達GRM4的細胞，在熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP的熒光表達情況；將篩選后的穩(wěn)定表達GRM4細胞和對照細胞按5×10個/孔接種于6孔板完全培養(yǎng)基中，孵育24 h后，采用Trizol法提取細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-PCR方法檢測兩組細胞中GRM4基因表達的情況。

1.5 Western blotting檢測GRM4的表達

RIPA 裂解液提取細胞總蛋白質(zhì)，按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明書操作測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，用50 g/l脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，加以50 g/L脫脂牛奶1∶1 000稀釋的抗兔Flag抗體，4 ℃過夜，TBS-T洗膜后，加以50 g/l脫脂牛奶1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，37 ℃溫育1 h，TBS-T洗膜，ECL液顯影，β-actin作為內(nèi)參蛋白定量。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的獲得

以非病毒質(zhì)粒3×Flag-GRM4為模板PCR擴增獲得目的基因DNA后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約為2700 bp明亮特異的目的條帶，與GRM4的分子量大小相符(2736 bp)(圖1)。

圖1 PCR擴增目的基因GRM4的電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將重組慢病毒質(zhì)粒送至華大公司測序驗證，經(jīng)序列比對后證實插入序列無誤，表明重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組GRM4慢病毒的包裝

GRM4慢病毒載體表達質(zhì)粒和慢病毒空載體質(zhì)粒pCDH-vector與包裝病毒系統(tǒng)質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共同轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染1周后收集病毒上清液。

2.4 MDA-MB-231細胞感染、穩(wěn)定株的篩選及鑒定

在熒光顯微鏡下可觀察到重組GRM4慢病毒感染后的細胞和對照細胞均帶有綠色熒光，證明病毒成功感染細胞。進一步將感染過的細胞傳代，于40×顯微鏡下可觀察到轉(zhuǎn)染的細胞生長情況與正常細胞相比，細胞形態(tài)基本一致，細胞數(shù)量明顯增多，生長狀況良好；證明轉(zhuǎn)染細胞群培養(yǎng)成功。

2.5 RT-PCR法和Western blot法檢測感染細胞中GRM4表達

實時熒光PCR檢測結(jié)果顯示重組慢病毒感染的細胞中GRM4基因mRNA表達水平明顯高于對照組(圖2A)。Western blot 檢測結(jié)果表明，重組慢病毒感染的細胞中GRM4蛋白表達量明顯高于對照組(圖2B)。綜上所述，穩(wěn)定表達GRM4的MDA-MB-231細胞株構(gòu)建成功。

A為RT-PCR法檢測法，B為Western blot檢測法。

3 討論

代謝型谷氨酸受體是1個龐大的受體家族，它主要參與學(xué)習(xí)、記憶、疼痛的傳導(dǎo)以及維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這些受體被激活后通過G-蛋白效應(yīng)酶、腦內(nèi)第二信使等組成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起作用，產(chǎn)生較緩慢的生理反應(yīng)。有研究表明，谷氨酸信號通路的紊亂可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。最初，對于代謝型谷氨酸受體的研究大多集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面。事實上，谷氨酸及其受體在外周組織中也有廣泛分布[9]，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)這些受體不僅參與神經(jīng)突觸的調(diào)控，還在細胞增殖、分化和生存方面發(fā)揮重要作用[10]。新近研究表明，GRM5在肝臟中具有表達，且在與肝臟相關(guān)的病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，GRM5的表達及活性升高可能是導(dǎo)致肝細胞癌變的重要原因[11]。

GRM4主要是突觸前谷氨酸受體，其在控制運動的基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路的數(shù)個關(guān)鍵位置表達[4]，參與突觸前興奮性谷氨酸信號的神經(jīng)傳遞。GRM4可在人的骨肉瘤細胞中表達[6,12]，并且骨肉瘤組織中GRM4的高表達與預(yù)后不良相關(guān)[13]。此外，GRM4已經(jīng)被證明與許多腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)，如結(jié)直腸癌[5]，橫紋肌肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤[14]。肖斌等人的研究發(fā)現(xiàn)GRM4能夠促進乳腺癌細胞的增殖能力[7]。根據(jù)GRM4的前期研究報道及代謝型谷氨酸受體各亞型在多種腫瘤進程中的作用，我們推測GRM4可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

細胞基因轉(zhuǎn)染有多種載體可供選擇，如質(zhì)粒、脂質(zhì)體、反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒等，其中慢病毒載體以其高感染率、高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達、宿主范圍廣及安全性好等特點，已成為真核系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移的有力工具。本研究通過基因重組技術(shù)將GRM4基因插入到慢病毒載體中，構(gòu)建了重組慢病毒載體質(zhì)粒。隨后，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染到239T細胞中，進行病毒包裝。用重組慢病毒感染MDA-MB-231細胞，經(jīng)藥物篩選和實驗鑒定后，成功獲得穩(wěn)定表達GRM4蛋白的細胞株。穩(wěn)定表達GRM4蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細胞株的獲得，可作為GRM4 蛋白過表達載體應(yīng)用于腫瘤等疾病的功能研究，有助于從細胞和分子水平深入探討GRM4 蛋白在乳腺癌細胞的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。