克羅恩病（Crohn's disease，CD）是一種腸道的持續(xù)性慢性炎癥疾病，其發(fā)病機(jī)制至今未明[1]，且病變呈跳躍性分布，病變腸段之間可存在正常腸段，病變腸段與正常腸段的分布尚無(wú)明顯規(guī)律可循。是何種機(jī)制造成了CD發(fā)病部位差異性如此巨大的特點(diǎn)？大量研究表明CD的病變部位分布可能與淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān)，歸巢受體的表達(dá)差別可能決定了病變腸段的分布。那么淋巴細(xì)胞歸巢又受何種上游炎癥途徑調(diào)控與介導(dǎo)？這一現(xiàn)象值得深入研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 對(duì)象 選取廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院于2014年1月—2017年12月經(jīng)腸鏡及病理確診為CD的22例患者作為研究對(duì)象，年齡為18～39歲，平均年齡（27.0±4.2）歲；其中，男性12例，女性10例。另設(shè)10名行腸鏡示正常的健康人作為空白對(duì)照。

1.1.2 材料和儀器 CCR9、TLR4引物來(lái)源于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。9700PCR儀來(lái)源于美國(guó)ABI公司。兔抗人CCR9、TLR4及羊抗兔二抗來(lái)源于美國(guó)SantCruz公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本的采集 22例患者于腸鏡下分別在病變腸段及正常腸段取得黏膜組織，10名健康人亦于腸鏡下取組織標(biāo)本。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)CCR9、TLR4在核酸水平的表達(dá) 提取結(jié)腸組織RNA后RT-PCR檢測(cè)CCR9、TLR4的表達(dá)，95℃ 3 min，95℃40 sec；54 ℃ 50 sec（β-actin），59 ℃ 50 sec（CCR9、TLR4）；72℃ 50 sec共30循環(huán)；72℃ 10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳，計(jì)算積分光密度。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)CCR9、TLR4在蛋白水平的表達(dá) 結(jié)腸標(biāo)本蛋白提取后上樣于凝膠，于86 V下電泳80 min，轉(zhuǎn)膜1 hr，封閉1 hr。分別加入一抗1 hr。洗去一抗；封閉液處理。加入對(duì)應(yīng)二抗1 hr。洗去二抗。顯色4 min，顯影1 min，定影5 min。計(jì)算條帶的積分密度。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pearson分析法分析各計(jì)量資料之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)CCR9、TLR4在CD患者腸道不同病變部位的表達(dá)

CD患者病變腸段組CCR9、TLR4的表達(dá)高于CD患者正常腸段組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD患者正常腸段組、CD患者病變腸段組均高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常人結(jié)腸內(nèi)未觀察到CCR9、TLR4表達(dá)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)CCR9、TLR4的表達(dá)

表1 RT-PCR檢測(cè)各組樣本CCR9、TLR4的表達(dá)（±s）

表1 RT-PCR檢測(cè)各組樣本CCR9、TLR4的表達(dá)（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與CD患者正常腸段組比較，#P＜0.05

正常組（n=10） 0 0 CD患者正常腸段組（n=22） 0.54±0.18＊ 0.11±0.02＊CD患者病變腸段組（n=22） 0.85±0.23＊# 0.32±0.07＊#

2.2 Western blotting檢測(cè)CCR9、TLR4在CD患者腸道不同病變部位的表達(dá)

CD患者病變腸段組織中CCR9、TLR4的表達(dá)高于CD患者正常腸段，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD患者正常腸段組、CD患者病變腸段組均高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常人結(jié)腸內(nèi)未觀察到CCR9、TLR4表達(dá)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 Western blotting檢測(cè)CCR9、TLR4的表達(dá)

表2 Western blotting檢測(cè)各組樣本CCR9、TLR4的表達(dá)（±s）

表2 Western blotting檢測(cè)各組樣本CCR9、TLR4的表達(dá)（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與CD患者正常腸段組比較，#P＜0.05

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2.3 CCR9與TLR4表達(dá)水平的相關(guān)性

CCR9與TLR4在核酸表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)（r=0.842，P＜0.05）。CCR9與TLR4在蛋白表達(dá)水平上亦呈明顯正相關(guān)（r=0.791，P＜0.05）。

3 討論

CD的發(fā)病機(jī)制一直是當(dāng)前胃腸道疾病的研究熱點(diǎn)之一。有學(xué)者提出了淋巴細(xì)胞歸巢（lymphocyte homing，LH）可能作為CD發(fā)病的始動(dòng)因素[2]。國(guó)內(nèi)外已有動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)在IBD的動(dòng)物模型中，可觀察到LH的活化水平升高。類(lèi)似的研究都表明，LH水平的升高是腸道細(xì)胞免疫的炎癥反應(yīng)中重要的一環(huán)，其與IBD的發(fā)病密切相關(guān)[3-4]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在CD患者病變部位，趨化因子受體9（chemokine receptor 9，CCR9）的表達(dá)明顯升高，CCR9是淋巴細(xì)胞歸巢重要的受體之一，其升高說(shuō)明局部淋巴細(xì)胞歸巢的活化，而CCR9的升高程度與病變部位的炎癥反應(yīng)呈正比，說(shuō)明淋巴細(xì)胞歸巢介導(dǎo)了下游炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，其表達(dá)的升高與發(fā)病部位相關(guān)[5-8]。這與已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相一致的。雖然淋巴細(xì)胞歸巢參與了CD的發(fā)病機(jī)理，但什么原因?qū)е铝薈D局部病變部位炎癥的起始及放大，使得相對(duì)整個(gè)腸道來(lái)說(shuō)，只有局部特定部位才會(huì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞歸巢水平的升高？本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞歸巢的受體CCR9與Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）密切相關(guān)，在CD患者的病變部位，不僅可觀察到TLR4的明顯升高，而且CCR9也與其保持一致；CD患者腸道的正常部位仍有TLR4的升高，且CCR9亦與其保持一致，這一現(xiàn)象值得進(jìn)一步探討。已有相當(dāng)多的研究表明，CD的發(fā)病與TLR4密切相關(guān)[9-10]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)，TLR4不但參與了CD的發(fā)病，而且其介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞歸巢也是形成CD病變處于腸道不同部位的重要原因。Toll樣受體率先對(duì)原本耐受的微生物或其成分形成應(yīng)答而不再耐受，Toll樣受體活化后即通過(guò)其跨膜傳遞信號(hào)的特點(diǎn)相繼激活下游炎癥因子，將免疫失衡的信號(hào)放大傳遞給細(xì)胞及體液免疫系統(tǒng)，由此最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞歸巢的水平變化，不僅如此，腸道不同部位的免疫穩(wěn)態(tài)并不一定一致，在免疫嚴(yán)重失衡的部位，調(diào)控淋巴細(xì)胞歸巢水平的免疫因素也更加活躍，這一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致歸巢的淋巴細(xì)胞大量游出并粘附至相關(guān)病變部位，最終導(dǎo)致了病變的發(fā)生[11-14]，這即可能成為CD的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，本試驗(yàn)認(rèn)為引起CD病變部位不同的機(jī)制可能與CCR9、TLR4介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān)，其具體機(jī)制為T(mén)oll樣受體介導(dǎo)的免疫失衡引起了病變部位淋巴細(xì)胞歸巢的活化。