史 璐，白書鋒，李凌云，馮海玲

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙體牙髓科 鄭州 450052

胞膜窖(Caveolae)是細(xì)胞膜上特異性內(nèi)陷微區(qū)，直徑50～100 nm，主要由膽固醇、鞘磷脂、鞘糖脂和窖蛋白(Caveolin)組成，其中前三者構(gòu)成Caveolae的脂質(zhì)核心，形成一個(gè)不溶于去垢劑的膜區(qū)域[1]。Caveolin是Caveolae的表面標(biāo)記蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為21 000～25 000，分為1、2、3三型，其中Caveolin-1是Caveolae最重要的表面功能蛋白。Caveolin-1自身形成同源多聚體，或與Caveolin-2結(jié)合形成異源多聚體，多表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中[2]；Caveolin-3主要分布于骨骼肌、心肌和平滑肌，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞也有表達(dá)[1]。Caveolae和Caveolin在細(xì)胞生物學(xué)功能中起著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞的胞吞胞飲、膽固醇和脂質(zhì)平衡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[1]。作者所在的課題組[3]對(duì)不同發(fā)育階段小鼠下頜第一磨牙牙胚中Caveolin-1的表達(dá)進(jìn)行了免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)期的牙胚上皮細(xì)胞中均有Caveolin-1表達(dá)，提示其可能在牙齒發(fā)育過程中發(fā)揮作用。Caveolae通常呈瓶頸狀，也可呈平鋪狀、管狀或形成分離的小泡進(jìn)而融合成直徑大于100 nm的結(jié)構(gòu)。Caveolae的形狀取決于細(xì)胞的生理狀況，如Caveolae耗盡膽固醇時(shí)呈扁平狀[4]。不同發(fā)育階段成釉細(xì)胞中Caveolae/Caveolin-1的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)定位仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬采用透射電鏡及免疫電鏡觀察小鼠牙胚發(fā)育過程中成釉細(xì)胞Caveolae結(jié)構(gòu)，為深入研究Caveolae和Caveolin-1在牙胚發(fā)育及成釉細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用提供組織學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器兔抗小鼠Caveolin-1單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；10 nm膠體金標(biāo)記羊抗鼠二抗、飽和苦味酸購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。LR White樹脂套裝、200網(wǎng)孔鍍膜鎳網(wǎng)、戊二醛、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛均購(gòu)自北京中興百瑞科技有限公司。鋨酸購(gòu)自上海勁馬生物科技有限公司。全自動(dòng)組織脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、組織切片機(jī)、攤片烤片機(jī)、顯微鏡病理成像系統(tǒng)、UC6型超薄切片機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Leica公司。日本日立H-7650型透射電子顯微鏡。

1.2標(biāo)本來源交配6～8周齡、體健的C57BL/6小鼠由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，胎齡計(jì)算以小鼠交配見到陰道栓后的中午定為胚胎發(fā)育第0.5天，新生小鼠出生當(dāng)天中午定為出生第0.0天。取胚胎發(fā)育第16.5天和第18.5天以及出生第2.0天的新生鼠下頜第一磨牙牙胚用于本實(shí)驗(yàn)研究。每個(gè)時(shí)期取3個(gè)樣本。胎鼠牙胚取出后立即置于4 ℃、30 g/L多聚甲醛(pH=7.4)固定12 h備用。出生第2.0天的牙胚固定后，經(jīng)EDTA脫鈣7 d備用。

1.3牙胚HE染色上述標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后，5 μm 厚連續(xù)冠狀切片，HE染色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察將標(biāo)本置于體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸中室溫固定2 h，乙醇和丙酮聯(lián)合梯度脫水，環(huán)氧樹脂812包埋，制備70 nm超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，于透射電鏡觀察成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.5成釉細(xì)胞中Caveolin-1的免疫電鏡定位標(biāo)記采用包埋后膠體金染色技術(shù)。①樣品制備：將標(biāo)本置于固定劑中冰上固定4 h(固定劑配方：40 g/L多聚甲醛+體積分?jǐn)?shù)0.1%戊二醛+體積分?jǐn)?shù)0.06%苦味酸+0.1 mol/L二甲砷酸鈉，pH=7.4)。PBS緩沖液(0.1 mol/L， pH=7.4)冰上漂洗4次×15 min/次；逐級(jí)乙醇4 ℃脫水。體積分?jǐn)?shù)100%乙醇-LR White置換及純LR White浸透過夜，最后包埋于0.5 mL 離心管中，室溫下放置3 h，50 ℃聚合3 h，再置于常溫環(huán)境中以保證LR White凝固。制備70 nm超薄切片，收集在200網(wǎng)孔的鍍膜鎳網(wǎng)上。②免疫染色：超薄切片以體積分?jǐn)?shù)10%正常羊血清封閉1 h后加入一抗(按1∶1 000稀釋)室溫作用2 h；PBS緩沖液洗滌3次×1 min/次，陰性對(duì)照片不加一抗；加入1∶40稀釋的膠體金標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫下孵育2 h；PBS緩沖液洗滌3次×1 min/次。最后經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染后，透射電鏡觀察并拍照。金標(biāo)蛋白結(jié)合處可見黑褐色顆粒。

2 結(jié)果

2.1不同發(fā)育時(shí)期小鼠成釉細(xì)胞HE染色及超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果見圖1、2。胚胎發(fā)育第16.5天(帽狀期)，成釉器呈帽狀，內(nèi)釉上皮呈矮柱狀，單層排列；電鏡下內(nèi)釉上皮細(xì)胞中可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞連接等細(xì)胞器，細(xì)胞膜上可見燒瓶狀凹陷結(jié)構(gòu)。胚胎發(fā)育第18.5天(鐘狀期)，成釉器進(jìn)一步分化，內(nèi)釉細(xì)胞分化為前成釉細(xì)胞，呈立方狀；電鏡下細(xì)胞膜表面亦可見燒瓶狀凹陷結(jié)構(gòu)。出生第2.0天(鐘狀晚期)，成釉細(xì)胞發(fā)育成熟，呈高柱狀，細(xì)胞核極性倒置，遠(yuǎn)離基底膜，成釉細(xì)胞開始分泌釉基質(zhì)；電鏡下成釉細(xì)胞中可見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，管腔較大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量形狀不一大小不等的囊泡、分泌顆粒和纖維樣成分，說明成釉細(xì)胞已分化成熟，具有分泌功能，同時(shí)細(xì)胞膜上亦可見燒瓶狀凹陷性結(jié)構(gòu)。

A、B：胚胎第16.5天；C、D：胚胎第18.5天；E、F：出生第2.0天。A:×200; C、E:×100; B、D、F:×400。iee：內(nèi)釉上皮; oee：外釉上皮; sr：星網(wǎng)狀層; si：中間層; dp：牙乳頭; ab：成釉細(xì)胞; ob：成牙本質(zhì)細(xì)胞

圖1不同發(fā)育時(shí)期小鼠下頜第一磨牙牙胚HE染色結(jié)果

A、B：胚胎第16.5天；C、D：胚胎第18.5天；E、F：出生第2.0天。A、C、E:×10 000；B、D、F:×30 000。細(xì)胞膜表面燒瓶狀凹陷性結(jié)構(gòu)如箭頭所示并局部放大；rer：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；m：線粒體；n：細(xì)胞核；j:細(xì)胞連接；g：高爾基復(fù)合體；sg:分泌顆粒；f：纖維樣成分；v：囊泡

圖2不同發(fā)育時(shí)期小鼠成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察結(jié)果

2.2不同發(fā)育時(shí)期小鼠成釉細(xì)胞中Caveolin-1的定位觀察結(jié)果見圖3。從小鼠胚胎第16.5天的牙胚上皮細(xì)胞至小鼠出生第2.0天的成釉細(xì)胞中均可見到Caveolin-1免疫陽(yáng)性顆粒沉積，主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。小鼠出生第2.0天成熟成釉細(xì)胞中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有免疫陽(yáng)性顆粒沉積。

A：胚胎第16.5天；B：胚胎第18.5天；C：出生第2.0天。箭頭所示為免疫陽(yáng)性顆粒；rer：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；n：細(xì)胞核圖3 不同發(fā)育時(shí)期小鼠成釉細(xì)胞中Caveolin-1免疫電鏡觀察結(jié)果(SP，×40 000)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先利用HE染色和透射電鏡觀察了不同發(fā)育階段成釉細(xì)胞的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)隨著成釉細(xì)胞的分化，細(xì)胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)都發(fā)生了顯著變化：細(xì)胞形態(tài)從矮立方狀變?yōu)楦咧鶢?；?xì)胞核遠(yuǎn)離基底膜，極性倒置；細(xì)胞器數(shù)量逐漸增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體數(shù)目增加，胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不等的分泌顆粒，意味著成釉細(xì)胞從未分化狀態(tài)逐漸分化為成熟的、具有分泌功能的細(xì)胞。這些與其他學(xué)者[5-6]的研究結(jié)果一致。

免疫電鏡觀察可見，成釉細(xì)胞細(xì)胞膜表面有Caveolin-1免疫膠體金顆粒沉積，說明在成釉細(xì)胞的細(xì)胞膜表面存在Caveolae結(jié)構(gòu)。Caveolae和Caveolin在多種細(xì)胞生物學(xué)功能中起到關(guān)鍵作用，特別是與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞胞飲、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、血管生成等密切相關(guān)。許多信號(hào)分子均聚集在Caveolae區(qū)，Caveolae被認(rèn)為是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺(tái)， Caveolin-1處于該平臺(tái)中各個(gè)信號(hào)通路的中心位置。在牙胚發(fā)育過程中，Caveolin-1 mRNA在胚胎第9.5天第一鰓弓間充質(zhì)細(xì)胞中及胚胎第16.5天下頜第一磨牙牙胚細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)水平增加[7]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，自牙胚發(fā)育的第13.5天，牙胚上皮中即可檢測(cè)到Caveolin-1的表達(dá)；隨著牙胚的發(fā)育，Caveolin-1始終表達(dá)于內(nèi)釉上皮細(xì)胞和成釉細(xì)胞中，且Caveolin-1 mRNA表達(dá)水平逐漸升高，在出生第2.0天增加最為顯著。在體外培養(yǎng)的成釉細(xì)胞中，封閉Caveolin-1基因可降低高糖型細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物和基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)[8]。這些研究結(jié)果表明Caveolin-1參與了牙胚發(fā)育和成釉細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)。

本實(shí)驗(yàn)在成熟成釉細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中也觀察到了Caveolin-1免疫膠體金顆粒沉積。有研究[9]認(rèn)為Caveolin-1是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成組裝完成的。此外，根據(jù)鈣釋放激活鈣通道(calcium release-activated calcium channel, CRAC)理論，CRAC是非興奮性細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的主要通道，它的開啟是由鈣庫(kù)耗竭所激發(fā)的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則是細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲(chǔ)庫(kù)。研究[10]表明：CRAC可能是釉質(zhì)成熟過程中成釉細(xì)胞鈣攝入的關(guān)鍵性機(jī)制，相關(guān)成員的基因突變可導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育缺陷。第二信使三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子短暫而迅速的釋放，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度的下降激活了位于胞膜的CRAC通道, 導(dǎo)致細(xì)胞外鈣通過胞膜持續(xù)流入，Caveolae被認(rèn)為是IP3釋放的位點(diǎn)[11]。同時(shí)，有學(xué)者[11]認(rèn)為Caveolin-1可能通過3種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)鈣離子流的形成，其中，攜帶有鈣離子的Caveolae囊泡可能通過鞘糖脂肌醇錨定受體參與的細(xì)胞內(nèi)吞作用將鈣離子運(yùn)輸至鄰近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。并且有研究[11]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中有些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)富集于富含Caveolin-1的細(xì)胞膜區(qū)域，這樣Caveolae囊泡不必遷移過遠(yuǎn)即可將大量的鈣離子運(yùn)輸至這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。本研究中觀察到的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中有Caveolin-1免疫膠體金顆粒沉積的現(xiàn)象能否成為支持上述理論和假說的組織學(xué)證據(jù)還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。但可以肯定的是：牙釉質(zhì)是高度礦化的組織，健康牙釉質(zhì)的形成依賴于穩(wěn)定的鈣離子供給。釉質(zhì)形成過程中，成釉細(xì)胞發(fā)揮著上皮性半透膜的功能轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子。成釉細(xì)胞既要操控大量鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)還要避免過量鈣離子的毒性作用[12]。成釉細(xì)胞必須精確調(diào)節(jié)、緩沖鈣離子流，控制細(xì)胞器中鈣離子的儲(chǔ)存、釋放和排出。Caveolae/Caveolin-1在細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了重要作用，因此有必要對(duì)Caveolae/Caveolin-1在成釉細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用進(jìn)行深入研究。