夏 鑫，呂萬強(qiáng)，張 薔，劉會(huì)敏，張衛(wèi)東

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種累及回腸、直腸、結(jié)腸的一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病。近年來，IBD的全球發(fā)病率一直在上升，在18～20歲的歐洲后裔中，每10萬人中有100～150人發(fā)病[1]。IBD主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(crohn′s disease，CD)[2]。CD一般情況下累及回腸和結(jié)腸，有些情況下可能影響腸道的任何區(qū)域[3]。UC主要累及結(jié)腸黏膜下層和直腸[4-5]。兩種疾病均有各自的臨床特點(diǎn)，同時(shí)又有著某種共同的發(fā)病機(jī)制。遺傳流行病學(xué)數(shù)據(jù)[1,3,5]表明，IBD發(fā)病的易感性是可遺傳的，迄今為止，已經(jīng)超過有200個(gè)基因被識別為IBD的潛在致病基因。2015年的一項(xiàng)跨種族全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide assiciation study，GWAS)的meta分析識別出了38個(gè)與這兩種疾病都相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，但這些位點(diǎn)僅能分別解釋CD和UC遺傳度的13.1%和8.2%[1]。本研究利用更加高效的統(tǒng)計(jì)方法——條件錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(conditional false discovery rate，cFDR)方法識別更多與歐洲人群IBD相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)集來源匯總數(shù)據(jù)集由國際炎癥性腸病遺傳學(xué)協(xié)會(huì)在其官網(wǎng)上發(fā)布，下載地址為https://www.ibdgenetics.org/downloads.html。最新的數(shù)據(jù)集為Latest combined GWAS and Immunochip trans-ancestry summary statistics，該數(shù)據(jù)來源于歐洲人群，CD數(shù)據(jù)集來自7個(gè)GWAS數(shù)據(jù)的meta分析匯總數(shù)據(jù)；UC數(shù)據(jù)集來自8個(gè)GWAS數(shù)據(jù)的meta分析匯總數(shù)據(jù)[1]。CD相關(guān)的meta分析涉及5 956個(gè)病例和14 927個(gè)對照；UC相關(guān)的meta分析涉及6 968個(gè)病例和20 464個(gè)對照[1]。

1.2數(shù)據(jù)集的處理首先整合數(shù)據(jù)，保留UC和CD數(shù)據(jù)集中均有包含的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，最終得到10 867 439個(gè)SNPs，對于每條染色體以每50個(gè)相鄰的SNPs為單位，以HapMap Phase3為參照，以歐洲人群的基因庫作為對照，計(jì)算SNPs兩兩之間的LD值(r2)，如果r2大于0.2，就刪除掉MAF較小的那個(gè)SNP，重復(fù)上面的刪減過程，直到剩下的SNPs之間不再有強(qiáng)連鎖現(xiàn)象，最終剩余140 983個(gè)SNPs。由于在meta分析之前，GWAS分析已經(jīng)對這些SNPs進(jìn)行了相應(yīng)的質(zhì)量控制[1]，因此，在本研究中不再考慮質(zhì)量控制問題。

1.3FDR方法的簡介假設(shè)同時(shí)研究的兩個(gè)疾病分別為疾病i和疾病j，則某SNP與疾病i相關(guān)的cFDR被定義為該SNP所對應(yīng)的pi和pj值均小于預(yù)先設(shè)定的閾值p0i和p0j，且在真實(shí)情況下SNPs與疾病i是沒有關(guān)聯(lián)的概率值，表示為cFDR(pi∣pj)=Pr(H0i∣pi≤p0i,pi≤p0j)。其中，pi代表某個(gè)SNP與疾病i之間關(guān)聯(lián)強(qiáng)度假設(shè)檢驗(yàn)的P值；pj代表了該SNP與疾病j之間關(guān)聯(lián)強(qiáng)度假設(shè)檢驗(yàn)的P值，H0i表示真實(shí)情況下該SNP與疾病i的發(fā)生沒有關(guān)系[6]。

將ccFDR定義為cFDR(CD|UC)和cFDR(UC|CD)中較大的一個(gè)[6]。如果某個(gè)SNP的ccFDR小于設(shè)定的閾值，就代表這個(gè)SNP和兩個(gè)表現(xiàn)型均相關(guān)。

1.4多效性的評估和曼哈頓圖利用分層Q-Q圖和分層TDR圖對UC和CD之間的多效性富集程度進(jìn)行評估。分層標(biāo)準(zhǔn)，pj≤1(即所有的SNPs都納入的一組)，pj≤0.1，pj≤0.01，pj≤0.001，pj≤0.000 1。如果圖中的散點(diǎn)向左偏離對角線則說明UC和CD之間存在多效性富集現(xiàn)象，而且偏離的程度越大，說明富集程度越強(qiáng)。

以軸遺傳變異位點(diǎn)的位置信息為x，以-log10cFDR或-log10ccFDR為y軸作曼哈頓圖。以y=2為基準(zhǔn)線，基準(zhǔn)線以上的散點(diǎn)對應(yīng)的遺傳變異位點(diǎn)為與疾病相關(guān)的SNPs。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理cFDR以及ccFDR的計(jì)算和曼哈頓圖的繪制均使用R3.42，SNPs的標(biāo)注和修剪均使用Plink 1.07，數(shù)據(jù)分析操作過程均在Ubuntu 16.04下完成。

2 結(jié)果

2.1多效性的評估見圖1。圖1A、B顯示，隨著與條件疾病對應(yīng)P值的減小，SNPs對應(yīng)的散點(diǎn)向左偏離對角線的程度逐漸增大，表明UC和CD之間存在很強(qiáng)的多效性富集現(xiàn)象。圖1C、D顯示，與CD或UC相關(guān)的多效性富集程度最強(qiáng)的分層(分層條件為0.000 1)TDR也最大。

A：以CD為條件的UC分層Q-Q圖；B：以UC為條件的CD分層Q-Q圖；C：以CD為條件的UC分層TDR圖； D：以UC為條件的CD分層TDR圖

圖1分層Q-Q圖和分層TDR圖

2.2UC相關(guān)位點(diǎn)識別結(jié)果有130個(gè)SNPs的cFDR(UC|CD)小于0.01，分別位于21條常染色體上(圖2)。有87個(gè)SNPs已被報(bào)道和UC相關(guān)[7-10]，43個(gè)SNPs是新發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。其中有5個(gè)新發(fā)現(xiàn)的SNPs被報(bào)道與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)或銀屑病相關(guān)[11-13]。這130個(gè)SNPs一共被標(biāo)注了144個(gè)基因，有70個(gè)基因被報(bào)道與UC相關(guān)聯(lián)[1,14]。

縱坐標(biāo)：以CD為條件與UC相關(guān)的SNPs的-log10cFDR；橫坐標(biāo)：常染色體編號以及對應(yīng)的位置；紅線以上的點(diǎn)：cFDR小于0.01的SNPs

圖2以CD為條件的UC的曼哈頓圖

2.3CD相關(guān)位點(diǎn)識別結(jié)果有174個(gè)SNPs的cFDR(CD|UC)小于0.01，分別位于22條常染色體上(圖3)。有88個(gè)SNPs已被報(bào)道和CD是相關(guān)，86個(gè)SNPs是新發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。有57個(gè)SNPs被報(bào)道與CD疾病相關(guān)；剩余的86個(gè)SNPs是新發(fā)現(xiàn)的遺傳位點(diǎn)，其中有6個(gè)新發(fā)現(xiàn)的SNPs被報(bào)道與乳糜瀉、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)或多發(fā)性硬化(MS)相關(guān)[2,4,15]。這174個(gè)SNPs一共被標(biāo)注了190個(gè)基因，有82個(gè)基因被報(bào)道與CD相關(guān)聯(lián)[1,16]。

縱坐標(biāo)：以UC為條件下與CD相關(guān)的SNPs的-log10cFDR；橫坐標(biāo)：常染色體編號以及對應(yīng)的位置；紅線以上的點(diǎn)：cFDR小于0.01的SNPs

圖3以UC為條件的CD的曼哈頓圖

2.4UC和CD同有相關(guān)位點(diǎn)分析結(jié)果共有75個(gè)多效性SNPs與UC和CD均有關(guān)，分別位于19條染色體上(圖4)。其中，有22個(gè)SNPs是新識別的和53個(gè)SNPs已經(jīng)被報(bào)道[1,8,13,16]。有3個(gè)新識別的SNPs被報(bào)道與RA或銀屑病(Psoriasis)有關(guān)。這75個(gè)多效性的SNPs被標(biāo)注了87個(gè)基因，其中有36個(gè)基因與這兩種疾病都相關(guān)[1,3,16-17]。有11個(gè)新識別的SNPs被標(biāo)注到了與UC和CD都相關(guān)的基因上，見表1。

縱坐標(biāo)：與UC和CD均相關(guān)的SNPs的-log10ccFDR；橫坐標(biāo)：常染色體編號以及對應(yīng)的位置；紅線以上的點(diǎn)：ccFDR小于0.01的SNPs

圖4 CD和UC的聯(lián)合曼哈頓圖表1 新識別的UC和CD共相關(guān)位點(diǎn)

#：被報(bào)道和RA或銀屑病相關(guān)

3 討論

利用cFDR新識別的SNPs中有一部分被標(biāo)注在和IBD相關(guān)的基因上，有些SNPs位于基因間或非編碼區(qū)，有些SNPs是位于疾病相關(guān)基因的編碼區(qū)甚至是UTR3或UTR5，如果這些位點(diǎn)發(fā)生突變，影響基因表達(dá)的可能性就會(huì)很大，那么這一部分的SNPs和疾病真實(shí)相關(guān)的可能性就會(huì)很大，這個(gè)結(jié)果也從側(cè)面證明了cFDR方法的可靠性。例如，本研究中一個(gè)和CD相關(guān)的SNP rs1738074，它的cFDR=0.008 8，位于CHR6的BP為159465977，且被標(biāo)注在基因TAGAP(Gene ID：117289)的UTR5區(qū)域，該基因和一些自身免疫性疾病是相關(guān)的，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)，乳糜瀉和多發(fā)性硬化[18-19]，而且這個(gè)基因被報(bào)道和CD是相關(guān)的[20]，如果該位點(diǎn)發(fā)生突變，很可能通過影響基因TAGAP的表達(dá)進(jìn)而對疾病的發(fā)生造成影響，且該基因同時(shí)和一些自身免疫性疾病相關(guān)，這與臨床數(shù)據(jù)顯示的IBD常伴有一些自神免疫性疾病相符合。同時(shí)進(jìn)一步證明使用的cFDR分析方法可以更加有效的識別與疾病相關(guān)的位點(diǎn)。另外，有兩個(gè)SNP rs3812609和SNP rs6563在本研究中被識別出與CD和UC都相關(guān)，它們對應(yīng)的ccFDR分別為0.005 6和0.000 66，這兩個(gè)位點(diǎn)均位于CHR 9上，BP分別為139408892和139389184，兩者的LD度量r2=0.032且rs3812609位于基因NOTCH1(Gene ID: 4851)的內(nèi)含子區(qū)域，rs6563位于該基因的UTR3區(qū)域。而對于基因NOTCH1而言，它是編碼了NOTCH家族的單通道跨膜受體[21-22]；NOTCH信號通路是一種高度保守的細(xì)胞間信號通路，它在及時(shí)的細(xì)胞譜系規(guī)范中扮演著重要的角色，包括內(nèi)分泌和外分泌腺的胰腺和來自共同的淋巴細(xì)胞前體T細(xì)胞譜系血統(tǒng)繼承，而且有研究[23-24]表明NOTCH信號通路的失調(diào)或故障會(huì)對腸道的健康造成很大的影響。而且這個(gè)基因在之前的研究中已被報(bào)道與UC和CD都相關(guān)[25]。

本研究通過使用cFDR方法，識別出了22個(gè)與兩個(gè)疾病都相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，這些新發(fā)現(xiàn)為探索UC和CD同有的致病機(jī)制提供了新的見解，并為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了可能的線索。但本研究也存在一定的局限性：首先，由于缺乏詳細(xì)的個(gè)人樣本數(shù)據(jù)，沒有多效性位點(diǎn)對表型影響方向的信息；此外，因?yàn)闊o法獲得樣本的臨床數(shù)據(jù)資料，無法將識別的遺傳位點(diǎn)與臨床結(jié)果聯(lián)系起來；最后，因?yàn)楸狙芯恐惺褂玫氖菂R總數(shù)據(jù)的一個(gè)子集，所以研究的結(jié)果中并沒有包含發(fā)現(xiàn)所有之前已報(bào)道的與CD和UC有關(guān)的位點(diǎn)和基因，且由于在對SNPs進(jìn)行修剪的過程中，刪除掉了那些具有較小MAF的SNPs，這會(huì)削弱cFDR方法對罕見變異的識別能力。因此，我們的這些新發(fā)現(xiàn)還需要更多的臨床數(shù)據(jù)資料和對應(yīng)的生物實(shí)驗(yàn)研究來做進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，通過利用cFDR方法將UC和CD的GWAS數(shù)據(jù)進(jìn)行二次挖掘，研究發(fā)現(xiàn)UC和CD之間的存在很強(qiáng)的多效性富集現(xiàn)象，并且識別出22個(gè)兩者共有的多效性遺傳位點(diǎn)。這些識別出的UC和CD之間的多效性遺傳位點(diǎn)，可能會(huì)為研究這兩個(gè)疾病之間共同的遺傳機(jī)制供新的見解或線索。