閆 杰，陳 靜，黃宇玲，葛慶鋒，刁增利，蘇鵬宇，李 燕

1)華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 河北唐山 063000 2)華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北唐山 063000

動(dòng)脈粥樣硬化是大、中動(dòng)脈動(dòng)脈壁的一種慢性炎癥性疾病，其特征是形成可部分或完全阻塞血管腔的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[1]。氧化低密度脂蛋白(oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL)在動(dòng)脈粥樣硬化形成中發(fā)揮重要作用[2]。凝集素樣氧化低密度脂蛋白清除受體1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein scavenger receptor-1，LOX-1)是負(fù)責(zé)結(jié)合、內(nèi)化和降解ox-LDL的主要受體之一[3]。LOX-1的激活與許多病理生理事件有關(guān)，包括內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期信號改變及細(xì)胞凋亡等[4]。研究[4]表明，動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域細(xì)胞凋亡顯著增加，研究ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡將有助于了解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

miRNA是非編碼單鏈分子，由約22個(gè)核苷酸組成，可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá)，miRNA與炎癥、氧化應(yīng)激和血管生成有關(guān)[5]。Let-7家族已被證實(shí)能夠通過與mRNA的3’-UTR結(jié)合來抑制目的基因的表達(dá)[6]，在炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[7-8]。Qin等[7]研究表明let-7c可通過抑制Bcl-xl來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Chen等[9]研究報(bào)道了let-7g與LOX-1之間負(fù)反饋調(diào)節(jié)，LOX-1 mRNA的3’-非翻譯區(qū)上含有l(wèi)et-7g結(jié)合位點(diǎn)。Bao等[10]研究報(bào)道，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者中Let-7d和Let-7i表達(dá)下調(diào)，提示Let-7d可能在動(dòng)脈粥樣硬化中起作用。本研究證實(shí)了ox-LDL能夠誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中Let-7d表達(dá)降低，并且過表達(dá)Let-7d可通過靶向LOX-1表達(dá)來逆轉(zhuǎn)ox-LDL對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料HUVECs購自美國ATCC；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；ox-LDL購自北京索萊寶科技有限公司；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國大連寶生物科技有限公司；KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒購自美國KAPA Biosystems公司；miRNA 模擬物對照(NC)、Let-7d模擬物購自上海吉瑪公司；pmirGLO質(zhì)粒、Dual Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司；Ⅷ因子抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；LOX-1抗體購自美國Sigma公司，Caspase 3、Bax、Bcl-2、GADPH抗體購自CST公司；辣根過氧化物酶聯(lián)二抗和ECL發(fā)光液購自德國Merck Millipore公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組將HUVECs用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用胰蛋白酶消化并傳代。用50 mg/L的ox-LDL分別處理HUVECs 0、24和48 h[11]，分別記為0 h組、24 h組和48 h組。將對數(shù)生長期HUVECs消化，取1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，分為4組，每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后融合度達(dá)50%時(shí)，用Lipofectamine 2000和OPTI-MEM培養(yǎng)基將NC與Let-7d轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，6 h后其中2組更換新鮮培養(yǎng)基，另外2組更換含有50 mg/L的ox-LDL的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，分別記為NC組、Let-7d組、NC+ox-LDL組和Let-7+ox-LDL組。

1.3HUVECs中Let-7d表達(dá)的RT-qPCR檢測按照Trizol說明書提取各組細(xì)胞總RNA，采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并于PCR儀上檢測Let-7d的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算Let-7d相對表達(dá)量。循環(huán)步驟為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)行熔解曲線分析。使用的引物序列如下。Let-7d：上游引物5’-AGGTTGCATAGTTTTAGGGCA-3’,下游引物5’-AAGGCAGCAGGTCGTATAGT-3’;U6：上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4HUVECs中相關(guān)蛋白表達(dá)的Westernblot法檢測取處理后的細(xì)胞用冷PBS洗2次，RIPA裂解

液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度并經(jīng)SDS-PAGE電泳分離各組樣品，蛋白分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶封閉后分別用LOX-1、Caspase 3、Bax、Bcl-2和GADPH(內(nèi)參)抗體以及辣根過氧化物酶聯(lián)二抗孵育，最后于曝光儀上用ECL發(fā)光液曝光顯影。用Image J軟件分析LOX-1、Caspase 3、Bax和Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Let-7d與LOX-1靶向調(diào)控關(guān)系的分析采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行Let-7d與LOX-1靶向調(diào)控關(guān)系的分析。采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)在線預(yù)測網(wǎng)站檢測到LOX-1 3’UTR與Let-7d存在結(jié)合位點(diǎn)，猜測LOX-1可能是Let-7d的一個(gè)靶基因。用Trizol提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用LOX-1的3’UTR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將其克隆至pmirGLO，構(gòu)建pmirGLO-LOX-1-WT載體。利用TaKaRa點(diǎn)突變試劑盒突變pmirGLO-LOX-1-WT上Let-7d結(jié)合位點(diǎn)來構(gòu)建pmirGLO-LOX-1-Mut載體。利用Lipofectamine 2000將LOX-1-WT或LOX-1-Mut報(bào)告載體聯(lián)合NC或Let-7d轉(zhuǎn)染至HUVECs中，48 h后使用Dual Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6HUVECs凋亡檢測取1×106個(gè)對數(shù)生長期HUVECs接種至6孔板中，在培養(yǎng)基中加入終濃度為50 mg/L的ox-LDL，培養(yǎng)48 h；另取轉(zhuǎn)染NC或Let-7d后的HUVECs加入50 mg/L的ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，冷的PBS洗2次，上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。0 h組、24 h組和48 h組間LOX-1蛋白表達(dá)及Let-7d表達(dá)的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；NC組和Let-7d組間熒光素酶活性的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；NC組、Let-7d組、NC+ox-LDL組和Let-7d+ox-LDL組間LOX-1蛋白和mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較均采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中LOX-1和Let-7d表達(dá)的變化結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞中LOX-1表達(dá)增加，Let-7d表達(dá)降低(圖1、表1)。

1：0 h組；2：24 h組；3：48 h組圖1 ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中LOX-1蛋白的表達(dá)表1 3組HUVECs中LOX-1蛋白及Let-7d相對表達(dá)量的比較

組別nLOX-1蛋白相對表達(dá)量Let-7d相對表達(dá)量0 h組30.19±0.020.98±0.0424 h組30.41±0.04*0.49±0.05*48 h組30.52±0.03*#0.34±0.03*#F70.580201.700P<0.001<0.001

*：與0 h組相比，P<0.05；#：與24 h組相比，P<0.05

2.2Let-7d與LOX1的靶向調(diào)控關(guān)系TargetScan在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)LOX-1是Let-7d潛在靶基因，LOX-1 3’UTR中含有與Let-7d反向互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列(圖2)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，Let-7d顯著降低了LOX-1-WT熒光素酶活性，而對LOX-1-Mut熒光素酶活性無影響(表2)。

圖2 Let-7d與LOX-1的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合表2 2組HUVECs中熒光素酶活性比較

組別n熒光素酶活性LOX-1-WTLOX-1-MutNC組30.97±0.061.02±0.08Let-7d組30.37±0.040.97±0.09t14.4100.719P<0.0010.512

2.3Let-7d對HUVECs中LOX-1mRNA和蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖3、表3。

2.4Let-7d對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖4、表4。

1：NC組；2：NC+ox-LDL組；3：Let-7d組；4：Let-7d+ox-LDL組

圖3 各組HUVECs中LOX-1蛋白表達(dá)的檢測表3 各組HUVECs中LOX-1蛋白和mRNA相對表達(dá)量的比較

1：NC組；2：NC+ox-LDL組；3：Let-7d組；4：Let-7d+ox-LDL組圖4 各組HUVECs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測表4 各組HUVECs細(xì)胞凋亡率及Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平的比較

組別n細(xì)胞凋亡率/%Caspase 3BaxBcl-2NC組34.75±0.580.84±0.080.29±0.031.15±0.13NC+ox-LDL組317.97±2.351.95±0.160.83±0.090.22±0.02Let-7d組33.97±0.460.88±0.090.21±0.021.28±0.14Let-7d+ox-LDL組39.31±1.021.13±0.110.55±0.050.64±0.06FLet-7d(P)8.358(0.028) 11.765(<0.001) 14.226(0.006)16.582(<0.001)Fox-LDL(P)26.845(<0.001)25.824(<0.001) 32.475(<0.001)22.437(<0.001)F交互(P)14.243(<0.001)15.429(<0.001) 24.725(<0.001)9.852(0.013)

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)關(guān)鍵特征，其中包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖缺陷和異常的細(xì)胞凋亡[12]。動(dòng)脈粥樣硬化中的高脂血通常會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷、死亡以及從血管壁的分離，進(jìn)而失去對白細(xì)胞的抗黏附性作用，增加內(nèi)皮壁對循環(huán)脂質(zhì)的滲透性，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變形成[13]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞對維持內(nèi)皮細(xì)胞壁完整性是必不可少的，其通過修復(fù)血管來抵抗損傷。已有研究[14]證實(shí)，高脂血癥導(dǎo)致的ox-LDL水平升高能夠通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖所必需的堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)來抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。LOX-1表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞膜上，動(dòng)脈粥樣硬化病理狀態(tài)下，LOX-1通常高表達(dá)，急性炎癥條件下，LOX-1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可作為可溶性LOX-1(sLOX-1)從細(xì)胞膜釋放到血液循環(huán)中，sLOX-1現(xiàn)已作為動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)潛在診斷和預(yù)后指標(biāo)[15-16]。LOX-1是ECs攝取ox-LDL的主要受體，在ox-LDL致HUVECs毒性作用中起了關(guān)鍵作用[17]。內(nèi)皮特異性LOX-1過度表達(dá)增加主動(dòng)脈ox-LDL水平，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、血管炎癥和斑塊形成[18]。因此，抑制LOX-1的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能代表了遏制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的治療新機(jī)制[19]。

先前的研究[4]表明，ox-LDL能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞中LOX-1的表達(dá)，且ox-LDL被LOX-1攝取，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生病理變化，包括衰老和細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果與其一致：用50 mg/L的ox-LDL處理HUVECs可上調(diào)LOX-1表達(dá)，并且也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。有研究[13]表明，升高的LOX-1亦進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞對ox-LDL的攝取，ox-LDL/LOX-1正反饋環(huán)路可能進(jìn)一步促進(jìn)了疾病的發(fā)展，提示LOX-1可能是治療血管內(nèi)皮功能障礙的靶標(biāo)?；贚OX-1在ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用，作者猜測miRNA可能參與調(diào)控ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中LOX-1的表達(dá)和活性。通過TargetScan生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LOX-1是Let-7d的潛在靶標(biāo)，并且ox-LDL可下調(diào)Let-7d的表達(dá)，這與ox-LDL誘導(dǎo)LOX-1表達(dá)結(jié)果呈相反趨勢。為進(jìn)一步研究Let-7d和LOX-1之間調(diào)控關(guān)系，本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了Let-7d能夠直接結(jié)合LOX-1 mRNA的3’UTR種子序列。此外，本研究將Let-7d模擬物轉(zhuǎn)染至HUVECs中，亦發(fā)現(xiàn)其可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的LOX-1表達(dá)，上述結(jié)果表明，Let-7d能夠靶向結(jié)合LOX-1的3’UTR抑制LOX-1表達(dá)。

細(xì)胞凋亡是通過涉及死亡受體或線粒體信號傳導(dǎo)途徑的兩個(gè)主要信號途徑誘導(dǎo)的。在線粒體凋亡信號通路中，細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放和Caspase信號通路的激活，Caspase 3被認(rèn)為是凋亡過程中的關(guān)鍵因子或調(diào)節(jié)因子[20]。細(xì)胞凋亡也受到幾種凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，包括作為抗死亡因子的Bcl-2和促凋亡因子的Bax[21]。研究[11]證實(shí)，ox-LDL能夠通過與LOX-1相互作用參與調(diào)控Fas介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并且ox-LDL 通過 LOX-1 下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制性細(xì)胞凋亡蛋白1的表達(dá)，從而激活細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中，ox-LDL在增加LOX-1蛋白表達(dá)水平的同時(shí)，增加了Caspase 3和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染Let-7d后則逆轉(zhuǎn)了ox-LDL對Caspase 3和Bax的誘導(dǎo)作用，并促進(jìn)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

總之，本研究結(jié)果表明，Let-7d通過抑制ox-LDL對HUVECs中LOX-1表達(dá)的誘導(dǎo)，逆轉(zhuǎn)了ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，對內(nèi)皮細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果將可能為內(nèi)皮損傷的分子機(jī)制和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制提供新見解，Let-7d可能成為治療動(dòng)脈粥樣硬化中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的新靶標(biāo)。