朱 倩，桂芬芳，羅子華，吳京華，黎發(fā)明，鄭建偉

1)深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東深圳 518110 2)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科 武漢 430030

胃癌作為消化系統(tǒng)高發(fā)惡性腫瘤，具有較高的病死率。近年來(lái)隨著診療技術(shù)的進(jìn)步，胃癌預(yù)后得到一定改善，但進(jìn)展期患者依然生存率較低[1]。研究[2-3]表明，早期轉(zhuǎn)移是影響胃癌預(yù)后的主要因素。因此，積極探討影響胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素對(duì)改善預(yù)后具有重要意義。CUG連接蛋白1(CUG-binding protein 1，CUGBP1)作為一種RNA連接蛋白家族成員，在mRNA翻譯及降解中發(fā)揮重要作用，與胚胎發(fā)育、組織形成、細(xì)胞分化關(guān)系密切[4]。近年來(lái)研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，CUGBP1在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，可能與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。本研究分析了胃癌組織中CUGBP1蛋白的表達(dá)；通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默人胃癌SGC7901細(xì)胞中CUGBP1基因，觀察細(xì)胞生物學(xué)特性的改變；以期為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1胃癌組織中CUGBP1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

1.1.1 臨床資料 組織標(biāo)本來(lái)源于2014年2月至2017年3月在深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院擇期行根治性手術(shù)治療的胃癌患者，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，共82例，患者術(shù)前均未接受放化療。其中，男45例，女37例，年齡40～74歲，≥60歲52例；腫瘤直徑≥5 cm17例；組織分型：腸型53例，彌漫型29例；分化程度：低分化26例，中高分化56例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲ、Ⅳ期44例；浸潤(rùn)深度：T1有13例，T2、T3共69例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。術(shù)中留取癌組織及距癌灶邊緣>5 cm并經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)的正常組織，福爾馬林固定，石蠟包埋保存。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.1.2 CUGBP1蛋白表達(dá)的檢測(cè) EnVision二步法免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，一抗兔抗人CUGBP1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。取石蠟標(biāo)本，切片，用二甲苯和梯度乙醇脫水，用過(guò)氧化氫除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用檸檬酸鹽(pH 6.0)行高壓抗原修復(fù)，按照試劑盒說(shuō)明完成檢測(cè)。一抗稀釋度1∶500。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，透明，鏡下觀察。胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物質(zhì)為陽(yáng)性細(xì)胞。高倍鏡下選取5個(gè)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行結(jié)果判定[8]：無(wú)染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色染色分別計(jì)為0、1、2、3分；無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%、10%～、51%～、>75%分別計(jì)為0、1、2、3、4分；兩項(xiàng)計(jì)分相乘，0～2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.2沉默CUGBP1基因后SGC7901細(xì)胞生物學(xué)特性的觀察

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 SGC7901細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。將SGC7901細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分3組，空白對(duì)照組、對(duì)照siRNA組和CUGBP1 siRNA組。CUGBP1 siRNA組、對(duì)照siRNA組用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)分別轉(zhuǎn)染 CUGBP1 siRNA(序列5’-CTAGCCGGGATTGAAGAATGCCGGATATTCAAGAGATATCCGGCATTCTTCAATCTTTTTAAT-3’)和對(duì)照siRNA序列(5’-CTAGCCCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTATCTCGAGATACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTTAAT-3’)，空白對(duì)照組不作任何處理。siRNA由上海銳賽生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成。

1.2.2 細(xì)胞中CUGBP1 mRNA的檢測(cè) Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司，PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，CUGBP1和內(nèi)參GAPDH引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CUGBP1上游引物序列：5’-GATCAGTGCAGCGTCTGTGT-3’，下游：5’-GTGTTGAGGTTCCCAGAGGA-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游：5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)40次。每組設(shè)3個(gè)平行孔。用2-ΔΔCt法計(jì)算CUGBP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海威奧生物科技公司。取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，接種于96孔板，密度1×104個(gè)/孔，在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于12、24、48、72和96 h時(shí)，將10 μL的MTT液加入各孔，培養(yǎng)4 h后加入100 μL的二甲基亞砜，充分振蕩，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測(cè) ①劃痕實(shí)驗(yàn)：在6孔板背面劃?rùn)M線，每孔5條平行線。取各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，常規(guī)胰蛋白酶消化后接種于6孔板，每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底時(shí)，用200 μL槍頭垂直于孔板底部從上而下劃線，槍頭要垂直，不能傾斜，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致，去除舊培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，分別于培養(yǎng)0、24和48 h時(shí)拍照，利用Image-Pro Plus軟件測(cè)量劃痕寬度。劃痕修復(fù)率=(0 h時(shí)劃痕寬度-24 h或48 h時(shí)劃痕寬度)/0 h時(shí)劃痕寬度×100%。②Transwell實(shí)驗(yàn)：Transwell小室和Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)Falcon公司。取各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，室溫條件下離心后留取細(xì)胞沉淀，用含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的無(wú)血清培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，密度為1×105mL-1。取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，將600 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加入下室，在含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，用棉簽輕輕除去散落細(xì)胞，拍照，取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，即為遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將Matrigel膠平鋪于Transwell小室，4 ℃風(fēng)干備用，其余步驟同前，檢測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 21.0完成數(shù)據(jù)分析。癌及癌旁正常組織中CUGBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)；不同臨床病理特征胃癌組織中CUGBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用成組資料的χ2檢驗(yàn)；3組細(xì)胞A值、劃痕修復(fù)率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織中CUGBP1蛋白的表達(dá)胃癌及癌旁正常組織中CUGBP1蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖1、表1。

圖1 胃癌(A)和癌旁正常組織(B)中CUGBP1蛋白的表達(dá)(EnVision，×400)

表1胃癌和癌旁正常組織中CUGBP1蛋白表達(dá)的比較例

癌旁正常組織胃癌組織陽(yáng)性陰性合計(jì)陽(yáng)性251439陰性38543合計(jì)631982

χ2=11.077,P=0.001

胃癌組織中CUGBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)76.8%，高于癌旁正常組織(47.6%)。不同臨床病

理特征胃癌組織中CUGBP1蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)表2。低分化、TNM分期為Ⅲ和Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為T(mén)2和T3、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中CUGBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率更高(P<0.05)。

表2 不同臨床病理特征胃癌組織中CUGBP1蛋白表達(dá)的比較 例(%)

2.2沉默CUGBP1基因后SGC7901細(xì)胞生物學(xué)特性的變化

2.2.1 3組細(xì)胞中CUGBP1 mRNA表達(dá)的比較 CUGBP1 siRNA組、對(duì)照siRNA組和空白對(duì)照組細(xì)胞中CUGBP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.19±0.16)、(2.14±0.11)和(2.22±0.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=104.472，P<0.001)，CUGBP1 siRNA組細(xì)胞中CUGBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于兩個(gè)對(duì)照組(P<0.05)。

2.2.2 3組細(xì)胞增殖能力的比較 見(jiàn)表3。CUGBP1 siRNA組細(xì)胞24、48、72和96 h時(shí)A值低于兩個(gè)對(duì)照組(P<0.05)。

表3 3組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)A值比較(n=6)

*：與CUGBP1 siRNA組比較，P<0.05

2.2.3 3組細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較 見(jiàn)表4、5。CUGBP1 siRNA組24和48 h時(shí)細(xì)胞劃痕修復(fù)率均低于對(duì)照siRNA組和空白對(duì)照組(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)亦低于對(duì)照siRNA組和空白對(duì)照組(P<0.05)。

表4 3組細(xì)胞劃痕修復(fù)率的比較(n=6) %

*：與CUGBP1 siRNA組比較，P<0.05

表5 3組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)的比較

*：與CUGBP1 siRNA組比較，P<0.05

3 討論

有研究[9-10]指出，腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)依然是胃癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加的主要因素，如何有效減少胃癌早期轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)已成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。CUGBP1位于人染色體11p11，與mRNA代謝密切相關(guān)[11]。楊昌俊等[12]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中CUGBP1蛋白呈高表達(dá)，并在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，CUGBP1是影響非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的重要因素。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中CUGBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織，低分化、TNM分期Ⅲ和Ⅳ期、浸潤(rùn)深度T2和T3及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中CUGBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，說(shuō)明CUGBP1可能參與了胃癌的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程，可能與不良預(yù)后有關(guān)。

有研究[14]指出，CUGBP1在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，CUGBP1 siRNA組細(xì)胞24、48、72和96 h時(shí)A值均低于對(duì)照siRNA組和空白對(duì)照組，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)亦低于兩對(duì)照組，說(shuō)明CUGBP1基因與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移能力關(guān)系密切，與Zhao等[15]和Liu等[16]的研究結(jié)論相同。

綜上所述，胃癌組織中CUGBP1蛋白呈高表達(dá)，且參與了胃癌細(xì)胞增殖、侵襲過(guò)程的調(diào)節(jié)，有望成為胃癌基因靶向治療的新靶位。