劉 亭，楊友輝，劉香香，馮 瑾，陳 雅，劉春花

1)貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點實驗室；貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物功效與利用國家重點實驗室 貴陽 550004 2)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 貴陽 550004 3)貴航貴陽醫(yī)院藥劑科 貴陽 550009

嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄受阻常常會引起高尿酸血癥，進而可引起腎功能損傷以及痛風等疾病[1]。嘌呤在體內(nèi)被黃嘌呤氧化酶氧化成尿酸，尿酸需要經(jīng)過腎小球濾過、腎小管重吸收、腎小管再分泌及分泌后重吸收等過程排出體外[2]。尿酸排泄量受腎小管尿酸轉(zhuǎn)運體的種類、活性及數(shù)量的影響，常見的尿酸轉(zhuǎn)運體包括尿酸鹽轉(zhuǎn)運體(hUAT)和SLC22A12基因編碼的尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運體(hURAT1)[3]。尿酸鹽從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到胞外需要hUAT的參與[4-5]，腎近端小管對尿酸鹽的重吸收及尿酸鹽的轉(zhuǎn)運主要靠hURAT1的作用，原尿中90%左右的尿酸是被hURAT1重吸收入血的[6-7]。目前臨床上治療尿酸血癥過高的藥物主要是通過抑制尿酸的合成及抑制黃嘌呤氧化還原酶的活性來降低尿酸的生成[8]，但這些藥物如苯溴馬隆、丙磺舒、別嘌醇等[9]常會引起胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損傷等毒副作用或者產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)、Stevens Johnson綜合征等嚴重不良反應(yīng)[10]，限制了其應(yīng)用。鑒于hURAT1在尿酸重吸收中的重要作用，其逐漸成為抗高尿酸藥物研發(fā)的重要靶點。構(gòu)建一個體外尿酸轉(zhuǎn)運細胞模型，成為抗高尿酸新藥篩選的迫切需要。目前所構(gòu)建的細胞模型多是采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法，雖然可以得到穩(wěn)定表達外源蛋白的細胞株，但是時間、人力和資源花費較多。作者首先構(gòu)建了SLC22A12重組質(zhì)粒，并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，構(gòu)建模型細胞SLC-HEK293，通過qRT-PCR、Western blot檢測模型細胞中SLC22A12 mRNA和hURAT1蛋白的表達量，并使用超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)考察其對尿酸鈉的攝取能力，確證模型是否建立成功。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人胚腎細胞HEK293購自中國生命科學(xué)院細胞庫，貨號GNHu43。SLC22A12基因(NM_144585.3)和BM無縫克隆試劑盒(批號CL116-01)由博邁德基因技術(shù)有限公司提供；GV142質(zhì)粒(批號V79020)購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(批號25300-054)和DMEM高糖培養(yǎng)基(批號8778619)購自Gibco公司；胎牛血清(批號P30-3302)購自PAN公司；FuGENE?6轉(zhuǎn)染試劑(批號0000254749)、MTS(批號G3582)和Eastep?Super總RNA提取試劑盒(批號7020001018)購自Promega公司；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號AK5301)、SYBR?Premix Ex TaqⅡ(批號A7005-1)購自TaKaRa公司；PCR引物由生物工程上海股份有限公司合成；抗hURAT1抗體(批號ab198791)、抗GAPDH抗體(批號ab8245)及相應(yīng)二抗購自Abcam公司。倒置熒光顯微鏡(型號TS100)購自Nikon公司；凝膠成像儀(Syngene型號)購自G-BOX公司；凝膠分析軟件(版本號Quantity One 4.6.2)、電泳儀(型號PowerpacTMBasic)、實時熒光定量PCR儀(型號CFX96)購自Bio-Rad公司；核酸蛋白紫外測定儀(型號BioMate 3S)、高速冷凍離心機(型號Fresco17)購自Thermo公司。

1.2質(zhì)粒GV142-SLC22A12的構(gòu)建與鑒定用Hind Ⅲ andEcoRⅠ 酶對GV142質(zhì)粒和SLC22A12片段雙酶切，切膠回收后用BM無縫克隆試劑盒將載體與SLC22A12連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TOP10菌株(批號C1210-1，購自北京索萊寶科技有限公司)，于37 ℃培養(yǎng)箱中、在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h。挑取單克隆于含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)12 h。利用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，用Hind Ⅲ 和EcoRⅠ酶對其進行雙酶切鑒定，并用10 g/L的瓊脂糖電泳檢測酶切結(jié)果。同時挑取陽性克隆送檢測序。

1.3HEK293細胞的培養(yǎng)用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度達80%時，用胰蛋白酶消化后按1∶4比例傳代。

1.4SLC22A12瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞條件的優(yōu)化

1.4.1 轉(zhuǎn)染比例的優(yōu)化 選取生長狀態(tài)良好的HEK293細胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，將細胞稀釋成1×105mL-1，以2 mL/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞的融合度達70%時，進行轉(zhuǎn)染。取4支1.5 mL無核酸離心管，每管加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基后，再分別加入FuGENE?6 轉(zhuǎn)染試劑10、8、6、4 μL，混合均勻。靜置5 min后分別加入GV142-SLC22A12質(zhì)粒2 μg，使其轉(zhuǎn)染比例[試劑(μL)∶質(zhì)粒(μg)]分別為5∶1、4∶1、3∶1和2∶1，混合均勻靜置15 min。6孔板換液后，加入混合物，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度。

1.4.2 質(zhì)粒量的優(yōu)化 取生長狀態(tài)良好的HEK293細胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞密度至1×105mL-1，鋪6孔板，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到65%時，按照轉(zhuǎn)染比例為3∶1進行轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染條件：9 μL試劑∶3 μg質(zhì)粒、6 μL試劑∶2 μg質(zhì)粒和3 μL試劑∶1 μg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度。

1.5細胞中SLC22A12mRNA表達的qRT-PCR檢測取生長狀態(tài)良好的HEK293細胞，分為兩組，分別轉(zhuǎn)染GV142空質(zhì)粒(HEK293組)和GV142-SLC22A12質(zhì)粒(SLC-HEK293組)。轉(zhuǎn)染24 h后，利用Eastep?Super總RNA提取試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA稀釋10倍后作為模板進行qRT-PCR。反應(yīng)體系：模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各0.8 μL，SYBR?Premix Ex TaqⅡ10 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸60 s。SLC22A12上游引物5’-AGTCGGCACGATGGCTCCTC-3’,下游引物5’-CCGCATGGCTGAAAGCAAGA-3’;GAPDH上游引物5’-GGTCCTGGTTCTCATTCCT-3’,下游引物5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt方法計算目的mRNA的相對表達量。

1.6細胞中hURAT1蛋白表達的Westernblot檢測細胞分組和處理同1.5。轉(zhuǎn)染24 h后，裂解細胞，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干轉(zhuǎn)儀恒壓25 V轉(zhuǎn)膜30 min，封閉30 min，分別用抗hURAT1抗體(按1∶200稀釋)和抗GAPDH抗體(按1∶2 000稀釋)孵育1 h，洗膜后加入二抗(按1∶4 000稀釋)孵育1 h，洗膜后用ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One軟件分析灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計算hURAT1和GAPDH條帶灰度值的比值。

1.7SLC-HEK293細胞功能的驗證

1.7.1 尿酸鈉對SLC-HEK293細胞的安全濃度 參照Shin等[11]的方法，稍作調(diào)整。將SLC-HEK293和HEK293細胞接種于6孔板，分別用100、200、400、600、800和1 000 μmol/L的尿酸鈉(樣品組)于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。棄培養(yǎng)上清，用無血清培養(yǎng)基以100 μL/孔洗板2次，加入無血清培養(yǎng)基100 μL和MTS 5 μL，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。于490 nm波長下測定其吸光度(A)。以不加尿酸鈉的細胞作為對照組，以無血清培養(yǎng)基的A為背景值，計算細胞存活率。細胞存活率=(A樣品組-A背景值)/(A對照組-A背景值)×100%。

1.7.2 尿酸鈉攝取速率的測定 參照Shin等[11]的方法，稍作調(diào)整。將SLC-HEK293和HEK293細胞接種于6孔板，分別用10、20、40、80、160和320 μmol/L的尿酸鈉于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，PBS清洗2次后，用RIPA裂解細胞。取裂解液按1∶6的體積比加入甲醇沉淀蛋白，于4 ℃以12 000g離心30 min，取上清用UPLC-MS/MS測定兩種細胞對尿酸鈉的攝取速率[尿酸攝取總量/(蛋白總量·攝取時間)]。

1.7.3 色譜與質(zhì)譜條件 Waters Van Guard BEH C18色譜柱(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)柱和保護柱(2. 1 mm × 50 mm，17 μm)；柱溫：45 ℃；進樣體積：2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A含體積分數(shù)0.1%甲酸的乙腈，B含體積分數(shù)0.1%甲酸的水；梯度洗脫：10% B(0～2 min)，10%～90% B(1.5～4 min)，100% B(4～6 min)。質(zhì)譜采用選擇離子監(jiān)測(SIR)和電噴霧離子源(ESI)檢測。錐孔電壓為30 V、50 V；碰撞電壓分別為15 V、40 V，以5-氟尿嘧啶為內(nèi)標用于定量正離子對(m/z)：166.8(尿酸鈉)，126.75(5-氟尿嘧啶)。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進行分析，應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗比較兩組細胞中SLC22A12 mRNA、hURAT蛋白水平的差異，應(yīng)用單因素方差分析比較不同濃度尿酸鈉對細胞存活率的影響，應(yīng)用2×6析因設(shè)計的方差分析比較兩組細胞對尿酸鈉攝取能力的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)粒GV142-SLC22A12的酶切鑒定結(jié)果見圖1。由圖可知，重組質(zhì)粒的大小在7 kb左右，雙酶切后產(chǎn)生了2條條帶，1.6 kb為目的基因片段，5.4 kb為GV142載體片段，均與理論大小符合。陽性克隆測序結(jié)果顯示插入片段與目的基因序列一致。

M1、M2：DNA Marker；1：GV142-SLC22A12；2：雙酶切圖1 質(zhì)粒GV142-SLC22A12的鑒定

2.2轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

2.2.1 轉(zhuǎn)染比例的優(yōu)化 隨著轉(zhuǎn)染比例的增加，轉(zhuǎn)染細胞中綠色熒光強度先增加后降低；當轉(zhuǎn)染比例為3∶1時，熒光強度最強(圖2)，說明3∶1為最佳轉(zhuǎn)染比例。

2.2.2 質(zhì)粒量的優(yōu)化 在轉(zhuǎn)染比例為3∶1條件下，隨著質(zhì)粒量的增加，綠色熒光強度先增加后減??；當質(zhì)粒量為2 μg時，熒光強度最高(圖3)，說明質(zhì)粒量為2 μg時，轉(zhuǎn)染效率最高。

2.3兩種細胞中SLC22A12mRNA和hURAT1蛋白的表達見表1。由表1可知，與HEK293相比，SLC-HEK293細胞中SLC22A12 mRNA和hURAT1蛋白的表達水平顯著增加(P<0.001)。

A：5∶1；B：4∶1；C：3∶1；D：2∶1圖2 不同轉(zhuǎn)染比例的轉(zhuǎn)染效果(×100)

A：3 μg；B：2 μg；C：1 μg圖3 試劑和質(zhì)粒不同用量的轉(zhuǎn)染效果(×100)

表1兩種細胞中SLC22A12mRNA和hURAT1蛋白的表達

組別nSLC22A12 mRNAhURAT1蛋白HEK29331.000±0.0330.194±0.022SLC-HEK2933152.190±19.1330.882±0.015t 13.68739.690P<0.001<0.001

2.4SLC-HEK293細胞的尿酸鈉攝取功能

2.4.1 不同濃度尿酸鈉對兩種細胞存活率的影響

見表2。當尿酸鈉的濃度大于400 μmol/L時，尿酸鈉降低了SLC-HEK293細胞的存活率(P<0.05)。因而在后續(xù)實驗中，尿酸鈉濃度均低于400 μmol/L。

2.4.2 兩種細胞對尿酸鈉攝取能力的比較 見表3。隨著尿酸鈉濃度的增加，HEK293和SLC-HEK293細胞對尿酸鈉攝取速率增加。和HEK293相比，SLC-HEK293細胞尿酸鈉攝取速率明顯增高(P<0.001)。

表2 不同濃度尿酸鈉對兩種細胞存活率的影響(n=6)

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05

表3 兩種細胞對尿酸鈉攝取能力的比較(n=3) nmol/(g·min)

F組別=4 695.610，F(xiàn)濃度=1 891.206，F(xiàn)交互=854.103，P均<0.001

3 討論

國內(nèi)高尿酸血癥發(fā)病率高, 但能有效用于降尿酸的藥物種類較少，尤其是促尿酸排泄的藥物。雖然苯溴馬隆排尿酸效果明顯，但毒副作用大，具有嚴重的肝臟毒性[12-13]。迄今為止，美國 FDA仍未批準苯溴馬隆上市，但由于沒有更好的排尿酸藥物，我國臨床上仍在使用苯溴馬隆[11]。促尿酸排泄新藥的開發(fā)，已經(jīng)成為一個緊迫的任務(wù)。

腎臟尿酸清除過低是90%的原發(fā)性高尿酸血癥的病因。研究[14]表明，SLC22A12基因編碼的hURAT1是腎小管上皮細胞最主要的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運體，抑制hURAT1活性將極大阻礙尿酸重吸收，從而促進尿酸排泄；hURAT1也逐漸成為降尿酸藥物開發(fā)的熱門靶點。目前國內(nèi)常用動物模型來進行排尿酸活性成分的篩選。動物實驗周期長，用藥物量大，成本高，不適合用于活性成分的初篩。因此，為了加快實驗進程，降低篩選成本，本文制備了一個SLC22A12瞬轉(zhuǎn)細胞模型。

在細胞選擇上，常用的腎源細胞有犬腎細胞MDCK和人胚腎細胞HEK293。由于MDCK不是人源細胞，并且預(yù)實驗中作者發(fā)現(xiàn)MDCK細胞的消化時間較長，且不容易制備成單個細胞，不利于后續(xù)實驗的開展。而HEK293細胞生長快、易消化，也容易被吹散為單個細胞，并且該細胞的轉(zhuǎn)染效率很高。因此，本實驗最終選擇了HEK293來構(gòu)建細胞模型。

在轉(zhuǎn)染方法的選擇上，常用的轉(zhuǎn)染方法一般分為病毒法和非病毒法。病毒法是以病毒為載體將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法，該方法具有易引起免疫原性、成本高、對實驗環(huán)境要求較高和插入細胞核中位置的不固定等缺點。非病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法中常用的有磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體法和非脂質(zhì)體法，其中非脂質(zhì)體法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染因具有高效低毒，無需去除血清或培養(yǎng)基，導(dǎo)入非脂質(zhì)體-DNA 復(fù)合物后也無需洗滌或更換培養(yǎng)基等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。因此，本實驗采用了非脂質(zhì)體制劑FuGENE介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。

從qRT-PCR和Western blot結(jié)果來看，SLC-HEK293細胞中SLC22A12 mRNA和hURAT1蛋白表達水平遠高于HEK293細胞，說明SLC22A12基因在SLC-HEK293中得到了高表達。尿酸鈉攝取實驗表明，SLC-HEK293細胞的尿酸鈉攝取速率高于HEK293細胞，表明SLC-HEK293細胞中高表達的hURAT1蛋白能發(fā)揮正常功能。

綜上所述，本實驗成功建立了SLC22A12瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞模型，該模型制備過程簡單，易于操作，是促尿酸排泄有效成分篩選的一個便利工具。