向利軍 賀翊峰 魯才杰 陳偉強 郭亮 季明芳

〔摘要〕 目的 研究Notch1在肝癌組織及細胞中的表達并初步探討Notch1下調(diào)后誘導肝癌細胞調(diào)亡的機制。方法 2016年3月至2016年9月于廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科收集32例肝癌病人樣本，利用qRT-PCR方法檢測肝癌癌組織及癌旁組織中Notch1基因的表達，免疫組化檢測組織中Notch1蛋白表達，siRNA沉默肝癌細胞Notch1表達，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，Western blot方法檢測Notch1、Bcl2和Bax蛋白表達，統(tǒng)計分析Notch1表達水平與肝癌病人臨床診斷指標甲胎蛋白（AFP）的相關性。結果 肝癌組織標本中Notch1高表達率為71.9%（23/32），明顯高于癌旁組織的28.1%（9/32），差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）； Pearson相關性分析顯示，Notch1與AFP存在正相關性（R2=0.3376，P=0.0036）；免疫組化驗證Notch1蛋白分別在肝癌癌組織樣本中高表達和癌旁組織中低表達；siRNA干擾Notch1基因表達后，鏡下發(fā)現(xiàn)肝癌細胞4401增殖抑制，流式檢測示轉(zhuǎn)染組明顯凋亡，蛋白免疫印跡顯示凋亡相關蛋白Bcl2蛋白下調(diào)、Bax表達上調(diào)。結論 Notch1與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相關，下調(diào)Notch1可誘導肝癌細胞凋亡，同時Notch1還可作為臨床治療肝癌的潛在新靶點。

〔關鍵詞〕 Notch1；甲胎蛋白；凋亡；肝癌SiRNA

〔中圖分類號〕R735.7 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.013

Mechanism of siRNA Targeting Notch1 on Apoptosis in Hepatocellular Carcinoma Cells

XIANG Lijun1，2， HE Yifeng1， LU Caijie1， CHEN Weiqiang3*， GUO Liang4， JI Mingfang5

（1 Postgraduate College of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong 524003， China； 2. Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong 524001， China； 3. Department of Hepatobiliary Surgery， Zhongshan People's Hospital， Zhongshan， Guangdong 528403， China； 4. Affiliated Zhongshan Hospital of Guangdong Medical University， Zhognshan， Guangdong 528415， China； 5. Cancer Institute of Zhongshan， Zhongshan， Guangdong 528403， China.）

〔Abstract〕 Objective To investigate the expression of Notch1 in liver cancer specimens and explain the mechanism of induction of apoptosis by downregulating Notch1 expression. Methods The 32 tissue samples were obtained from Hepatobiliary Surgery of the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College during March 2016 to September 2016. The expression of Notch1 gene in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues was detected by qRT-PCR. The expression of Notch1 protein was detected by immunohistochemistry. The expression of Notch1， Bcl2 and Bax protein in siRNA was detected by Western blot. The cells were transfected Notch1 siRNA. Apoptosis was detected by flow cytometry. The correlation of Notch 1 expression with the clinical diagnostic index of alpha-fetoprotein （AFP） were revealed by statistical analysis. Results The positive rate of Notch1 in tumor tissues was 71.9% （23/32） and negative rate was 28.1% （9/32）， the difference was statistically significant （P<0.01）. Pearson correlation analysis showed that there was a positive correlation between Notch1 and AFP（R2=0.3376， P=0.0036）. Immunohistochemical results confirmed that Notch1 protein was positive in hepatocellular carcinoma tissues. The data indicated that knockout of Notch1 expression by siRNA would inhibit the proliferation and induce the apoptosis in 4401 cells. In addition， the expression of Bcl2 was attenuated and the expression of Bax was enhanced. Conclusion Notch1 is associated with the development and progression of HCC and the induction of Hepatocellular carcinoma cells apoptosis is driven by down-regulation of Notch1. Notch1 can be used as a potential new target for clinical treatment of hepatocellular carcinoma.

〔Keywords〕 Notch1； alpha fetoprotein； apoptosis； hepatocellular carcinoma； siRNA

肝癌仍是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，雖然隨著科技的發(fā)展及治療手段的進步，肝癌病人的治療取得一定的進展，但肝癌發(fā)生、發(fā)展機制仍不明確，而且肝癌高復發(fā)，高轉(zhuǎn)移，導致肝癌患者總體預后仍然較差[1-2]。因此，探索肝癌發(fā)生、發(fā)展的機制及其臨床治療靶點對于肝癌的治療及提高生存率具有積極的作用。研究發(fā)現(xiàn)Notch1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，在乳腺癌、甲狀腺癌、直腸癌中均發(fā)現(xiàn)Notch1明顯高表達[3]。然而Notch1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及是否參與調(diào)控肝癌細胞凋亡并未見報道，本實驗通過qRT-PCR方法檢測肝癌癌組織及癌旁組織中Notch1基因的表達，siRNA沉默Notch1表達后觀察對肝癌細胞4401的影響，來探討Notch1在肝癌發(fā)生發(fā)展及調(diào)控肝癌細胞凋亡機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

于2016年3月至2016年9月收集32例肝癌標本，肝癌及癌旁組織均取自廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科手術切除標本，術后病理均為肝細胞肝癌，該實驗符合廣東醫(yī)科大學倫理委員會標準且取得病人同意。

1.2 實驗材料

Lipo 2000和DEPC 水購于美國Invitrogen公司；Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶生物工程公司；免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購于北京中杉生物技術公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide， PI）細胞凋亡檢測試劑盒購于杭州碧云天公司。Notch1（批號：3608S）、Bax（批號：5023S）、Bcl2（批號：3498S）和GAPDH（批號：2118L）多克隆抗體購于Cell Signaling Technology 公司。

1.3 原代細胞培養(yǎng)

人肝癌4401細胞分離于肝癌病人手術后肝癌組織，組織用滅菌手術刀片切切成1 mm見方小塊，加含20%胎牛血清和100單位/mL雙抗（青霉素 鏈霉素）的DMEM/F12培養(yǎng)基，置37 ℃ 5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)1周，肝癌細胞從原組織塊中伸出后生長，去除組塊后傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。細胞貼壁長滿80%傳代，0.25%胰蛋白酶消化，每2～3天傳代1次。實驗選用對數(shù)期生長細胞。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

按照Trizol試劑盒方法提取對應癌與癌旁組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μL cDNA模板配制PCR反應液上機，所檢測Notch1上游為5-CCCGTTCTTGAAATGTAGGCATC-3，下游5-TGTCTTTCCCCAGAAAAGGGTA-3；18 s上游5-CGGCGACGACCCATTCGAAC-3，下游5-GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3，擴增條件為：95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃后延伸10 s，10 μL體系，40個循環(huán)擴增。

1.5 免疫組化以及判定標準

收集手術切除的肝癌及癌旁組織，PBS清洗標本用含10%甲醛的福爾馬林固定過夜，每例樣本切取1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小組織塊，經(jīng)脫水、透明處理后由石蠟包埋，將包埋的組織標本置于切片機上均勻快速并連續(xù)的切成2～4 μm左右的切片，展片后置于載玻片1/3～2/3交界處。采用免疫組織化學（SP）染色，經(jīng)脫蠟、高溫熱抗原修復、封閉后滴加Notch1一抗（稀釋比例1∶150）后4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗1 h，最后由DAB顯色，蘇木精復染，封片。陽性表達率（%）=（Notch1表達陽性的腫瘤細胞數(shù)/所有腫瘤細胞數(shù)）×100%，陽性表達率大于10%即為陽性，小于10%為陰性。3個獨立觀察者分別選取5個高倍鏡下獨立視野進行診斷。

1.6 Western-blot方法檢測蛋白含量

提取細胞總蛋白，加入含1 mol/L PMSF的裂解液200 μL冰上裂解，由4 ℃ 13 000 r/min離心10 min后分別取上清液，蛋白濃度經(jīng)BCA法測定，經(jīng)SDS-PAGE （8%分離膠）電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜，加入發(fā)光液曝光，選取GAPDH蛋白作為內(nèi)參。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染

實驗分為對照組（Control）、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（si-NC）和siRNA轉(zhuǎn)染組（si-N1）。按照Lipo 2 000試劑盒進行轉(zhuǎn)染，采用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞融合度為90%時進行轉(zhuǎn)染，50 μL OPTI-MEMⅠ稀釋0.8 μg DNA，50 μL OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋2 μL Lipo 2 000，稀釋的Lipo 2000同稀釋的DNA輕輕混合后，將其加入到每孔中，來回搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24～48 h吸除無雙抗培養(yǎng)液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 流式細胞術

為檢測下調(diào)Notch1后肝癌細胞凋亡情況，細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后培養(yǎng)24 h，收集細胞并按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明進行染色處理后上機檢測細胞凋亡。實驗獨立進行，重復3次。

1.9 統(tǒng)計學方法

實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用“x±s”表示， 兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，運用皮爾森相關性分析檢測參數(shù)間的關系，檢驗水準α取值為0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌樣本中Notch1基因的表達及與臨床指標AFP的相關性

圖1A，1B所示，通過qRT-PCR方法分析同一病人肝癌及癌旁組織中Notch1的表達，發(fā)現(xiàn)32例肝癌組織中23例樣本Notch1高表達 （71.9%），9例低表達（28.1%），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。同時，圖1C所示，Notch1的表達與病人血清AFP含量存在正相關性（R2=0.3376，P=0.0036）。

2.2 肝癌樣本中Notch1蛋白的表達

免疫組化檢測Notch1蛋白的表達，結果進一步證實Notch1在肝癌組織中被激活（圖2）。

2.3 沉默Notch1后誘導肝癌細胞系4401調(diào)亡

Notch1轉(zhuǎn)染4401細胞，24 h后鏡下（×100）觀察肝癌4401細胞發(fā)生明顯凋亡（圖3A）；流式結果示siRNA-N1組細胞明顯發(fā)生凋亡（圖3B，3C）；Western blot檢測示Notch1蛋白表達降低，同時抗凋亡蛋白Bcl2表達下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)（圖3D）。

3 討論

Notch通路與腫瘤的相關性最先是在T細胞急性白血病中確定的[4]。然而，一旦當Notch1表達異常的時候，往往會表現(xiàn)出致癌的特性，譬如在原發(fā)性肝癌，胰腺癌中Notch1表達上調(diào)并表現(xiàn)出促細胞增殖，抑制細胞凋亡及分化的作用[5-6]。Notch途徑由跨膜家族受體（Notch 1-4），其配體（Jagged 1-2，Delta-like 1-3）組成[7]。通過受體與配體的相互作用轉(zhuǎn)導細胞信號，從而在細胞增殖、分化、凋亡、個體生長、發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用Notch1基因是Notch信號通路中跨膜蛋白受體之一，可與配體結合進入核內(nèi)并促進相應靶基因激活，從而導致疾病的發(fā)生[8]。同時，中國的肝癌病例數(shù)和因病死亡數(shù)占到了全球范圍內(nèi)的一半上[9]。有薈萃分析證實，在原發(fā)性肝癌和胃癌中，Notch1的高表達與腫瘤的的發(fā)生有著密不可分的關系[10-11]，同時還預示著病人的預后不良[12]。這些都提示Notch1參與了原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

如qRT-PCR及免疫組化結果所示，在肝癌組織中Notch1基因的表達較癌旁組織明顯升高，這進一步證實了Notch1在肝癌中被激活，Notch1可能與肝癌的發(fā)生相關。在近期有研究表明，Notch1還可以調(diào)節(jié)結腸癌腫瘤干細胞從而促使結腸癌的發(fā)生，同時還能激活干性基因使腫瘤細胞維持在低分化的狀態(tài)[13-14]。在臨床上，大約80%的肝癌患者血清中的甲胎蛋白含量升高，臨床上常將AFP作為診斷原發(fā)性肝癌的特異性腫瘤標志物，其對確立診斷、早期診斷、鑒別診斷的具有重要指示作用。在最近的一篇報道中，有人指出乙肝病毒通過刺激AFP的表達誘導肝細胞的重編程，還發(fā)現(xiàn)AFP在啟動肝癌干細胞進程中起到了重要的作用[15]。本文進一步研究了Notch1和甲胎蛋白（AFP）血清含量之間的關系，結果表明Notch1與AFP具有一定的相關性（R2=0.3376，bP=0.0036）。我們認為過表達Notch1是通過AFP誘導肝癌的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)沉默Notch1后誘導肝癌細胞系4401調(diào)亡。線粒體凋亡通路是常見的細胞凋亡通路，且主要受Bcl-2，Bax蛋白家族調(diào)控，Bcl-2是關鍵的抗凋亡蛋白，Bax是主要的促凋亡蛋白[16]，Bcl-2/Bax的比率能進一步反映了凋亡傾向[17]。Wu等[18-19]發(fā)現(xiàn)抑制Notch1表達可抑制腎癌細胞和結腸癌細胞的增殖并誘導其凋亡。所以通過siRNA沉默肝癌細胞中Notch1表達，在鏡下發(fā)現(xiàn)肝癌細胞可見細胞死亡，通過流式分析證實敲除Notch1的肝癌細胞發(fā)生凋亡。蛋白質(zhì)印跡法結果顯示：抗凋亡蛋白Bcl-2被下調(diào)，促凋亡蛋白Bax則被上調(diào)。這表明Notch1的下調(diào)將誘導肝癌細胞的凋亡。 綜上可知，本實驗證實了Notch1與肝癌的發(fā)生、肝癌病人AFP血清含量均具有一定的相關性。敲除Notch1后可以誘導肝癌細胞的凋亡，這也進一步證實了Notch1與肝癌間的關系。然而，Notch1參與肝癌的發(fā)生發(fā)展、誘導肝癌細胞調(diào)亡的具體機制以及能否作為潛在的診斷指標以及治療肝癌的新靶點還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] 范上達，邱宗祥，潘冬平.肝癌的綜合治療[J].中華消化外科雜志，2011，10（4）：241-246.

[2] FORNER A， LIOVET J M， Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet， 2012，379（9822）：1245-1255.

[3] LIU M. LEE D， CHEN C， et a1. IKKα activation of NOTCH links tumorigenesis via FOXA2 suppression[J]. Mol Cell， 2012，45（2）：171-184.

[4] ELLISEN LW， BIRD J， WEST D C， et al. TAN-1， the human homolog of the Drosophila notch gene， is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms[J]. Cell，1991，66（4）：649-661.

[5] 吳樂樂.Notch1信號通路對人肝癌SMMC 7721細胞中高純度CD133+細胞增殖和凋亡的影響[D].合肥：安徽醫(yī)科大學，2015.

[6] 易 超，蘇雅婷，丁 偉，等.Notch受體在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2016，16（34）：6684-6687.

[7] HORI K， SEN A， ARTAVANIS-TSAKONAS S. Notch signaling at a glance[J]. J Cell Sci， 2013，126（10）：2135-2140.

[8] FABIAN G， MARIO S. Emerging roles of Notch signaling in liver disease. Hepatology[J]. 2015，61（1）：382-392.

[9] CHEN W， ZHENG R， BAADE PD， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]. CA Cancer J Clin， 2016，66（2）：115-132.

[10] HUANG R， TANG Q， YOU Q， et al. Disparity expression of Notch1 in benign and malignant colorectal diseases[J]. PLoS One， 2013，8（12）：e81005.

[11] DU X， CHENG Z， WANG Y H， et al. Role of Notch signaling pathway in gastric cancer： a meta-analysis of the literature[J]. World journal of gastroenterology， 2014，20（27）：9191-9199.

[12] 宋 翔，張玲利，于紅剛.Notch1和p-Akt在結腸癌組織中的表達及其意義[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7（3）：1093-1096.

[13] NERADUGOMMA N K， SUBRAMANIAM D， TAWFIK OW， et al. Prolactin signaling enhances colon cancer stemness by modulating Notch signaling in a Jak2-STAT3/ERK manner[J]. Carcinogenesis， 2014，35（4）：795-806.

[14] GARCIA-HEREDIA J M， LUCENA-CACACE A， VERDUGO-SIVIANES E M， et al. The Cargo Protein MAP17 （PDZK1IP1） Regulates the Cancer Stem Cell Pool Activating the Notch Pathway by Abducting NUMB[J]. Clin Cancer Res， 2017.

[15] ZHU M， LI W， LU Y， et al. HBx drives alpha fetoprotein expression to promote initiation of liver cancer stem cells through activating PI3K/AKT signal pathway[J]. International Journal of Cancer， 2017，140（6）：1346-1355.

[16] BAGCI E Z， VODOVOTZ Y， BILLIAR T R， et al. Bistability in apoptosis： roles of bax， bcl-2， and mitochondrial permeability transition pores[J]. Biophys J， 2006，90（5）：1546-1559.

[17] PERUCHO J， CASAREJOS M J， RUBIO I， et al. The effects of parkin suppression on the behaviour， amyloid processing， and cell survival in APP mutant transgenic mice[J]. Exp Neurol， 2010，221（1）：54.

[18] WU K， HU L， HOU J. Selective suppression of Notch1 inhibits proliferation of renal cell carcinoma cells through JNK/p38 pathway[J]. Oncol Rep， 2016， 35（5）：2795-2800.

[19] 劉少瓊，楊 芳，禹正楊，等.姜黃素調(diào)控Notch1信號通路誘導結腸癌SW480細胞株凋亡[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2015，35（8）：13-16.