李玲 盧芳國 陳伶利 向琴 高強 魏科 胡玨 寧毅

〔摘要〕 目的 研究小檗堿體外抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）活性。方法 運用瓊脂擴散法、液體稀釋法測定并分析小檗堿對MRSA的抑菌環(huán)大小、最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）；運用96孔酶標板結晶紫法測定并分析小檗堿對MRSA的最小生物膜清除濃度（MBEC）。結果 與DMSO比較，小檗堿與氯霉素（陽性對照藥物）可顯著增加MRSA的抑菌環(huán)半徑（P<0.01），小檗堿對MRSA的MIC為0.2 mg/mL，MBC為0.4 mg/mL；小檗堿對MRSA的MBEC為0.2 mg/mL。結論 小檗堿對MRSA有比較明顯的抗菌、抑菌作用，其效應機制可能與其抑制細菌生物膜的形成有關。

〔關鍵詞〕 小檗堿；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；生物膜

〔中圖分類號〕R285 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.006

Effect of Berberine on the Activity of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Vitro

LI Ling， LU Fangguo， CHEN Lingli， XIANG Qin， GAO Qiang， WEI Ke， HU Jue， NING Yi*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study berberine on the activity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） in vitro. Methods The size of antibacterial annulus， minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of MRSA intervened by berberine were measured by Agar diffusion test and broth dilution test. The crystal violet staining method measured on 96 well Elisa-plate was applied to analyze minimal biofilm eradication concentration （MBEC）. Results Compare with DMSO， berberine and chloramphenicol （positive control drug） could significantly increase the antibacterial annulus radius of MRSA （P<0.01）. The MIC， MBC and MBEC of berberine against MRSA were 0.2 mg/mL， 0.4 mg/mL and 0.2 mg/mL， respectively. Conclusion Berberine shows obvious inhibition effect on MRSA， and its mechanism may be related to the inhibition of bacterial biofilm formation.

〔Keywords〕 berberine； methicillin-resistant Staphylococcus aureus； biofilm

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methieillin-resistant staphylococcus aureus， MRSA）是臨床上常見的毒力較強的細菌，是導致壞死性肺炎、壞死性筋膜炎、敗血癥等感染性疾病的重要病原體[1]。近年來該菌的感染日益增多，嚴重威脅人類健康。萬古霉素是目前臨床上確認的治療MRSA感染的有效藥物，但由于萬古霉素的濫用，萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度（MIC）提高，導致萬古霉素療效欠佳[2]。MRSA一旦發(fā)展為對萬古霉素普遍耐藥，其感染患者將面臨無藥可治的危險境地。因此，研發(fā)與篩選抗MRSA的新型藥物刻不容緩。天然植物特別是中草藥中蘊含著豐富的天然活性物質(zhì)，從中篩選抗MRSA藥物有良好的應用前景。筆者研究了小檗堿對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性影響，本文報道如下。

1 實驗材料

1.1 藥物與制劑

小檗堿：購自上海源葉生物科技有限公司，規(guī)格：20 mg，CAS號：2086-83-1，批號： B21379。實驗時用DMSO配制的16 mg/mL小檗堿母液，渦旋儀上振蕩直至粉末溶解，用無菌液體培養(yǎng)基稀釋小檗堿母液10倍至1.6 mg/mL，即含DMSO濃度為10%。

1.2 菌種及培養(yǎng)基

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科分離與鑒定的臨床耐藥株，湖南中醫(yī)藥大學病原免疫實驗室保存。菌種經(jīng)活化、鑒定后取對數(shù)生長期菌液進行實驗。實驗用的菌液濃度為1.5×108 cfu/mL。菌種的活化與培養(yǎng)用肉湯培養(yǎng)基及普瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2 方法

2.1 抗菌活性的測定

2.1.1 抑菌環(huán)大小的測定 運用瓊脂擴散法測定，具體操作如下：取直徑12 cm平皿，傾入培養(yǎng)基10 mL，冷凝后用滅菌的棉拭子蘸取供試菌菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，室溫干放置2～3 min。將直徑6 mm的無菌牛津杯置瓊脂平皿上，于杯中加濃度為1.6 mg/mL的小檗堿50 μL（即80 μg/杯），每種藥液設3個重復對照。37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，測抑菌環(huán)直徑，并求出每種藥液3個孔抑菌環(huán)半徑的平均值。同步設陽性藥物對照和陰性藥物。陽性藥物為氯霉素：30 μg/片（藥敏紙片法），陰性藥物為10%DMSO，加50 μl/孔。

2.1.2 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定[3] 運用液體稀釋法測定，具體操作如下：在96孔細胞培養(yǎng)板中，用液體培養(yǎng)基等倍稀釋小檗堿藥液（濃度為0.8 mg/mL～0.0125 mg/mL），每孔加稀釋小檗堿藥液100 μL，每孔加10 μL供試菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，以MTT法檢測各孔600 nm波長下吸光度值。同步設培養(yǎng)基對照孔、菌液對照孔、藥液對照孔。在培養(yǎng)基對照孔無菌生長和菌液對照孔有菌生長的情況下，分析判斷實驗孔結果。以完全無細菌生長（OD值=0）的最低濃度作為藥物對該菌的最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），以OD值突然升高前的臨界值為藥物最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。考慮到藥物本身有顏色，實驗結果的OD值為去掉藥物本底OD值后的余值。

2.2 最小生物膜清除濃度（MBEC）的測定[4]

運用96孔酶標板結晶紫法測定，具體操作如下：在96孔細胞培養(yǎng)板中，用液體培養(yǎng)基等倍稀釋小檗堿藥液（稀釋濃度為0.8 mg/mL～0.025 mg/mL），每孔先加稀釋小檗堿藥液100 μL，再加10 μL供試菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，去掉孔內(nèi)菌液，用生理鹽水洗3次培養(yǎng)板，并于每孔加入1%的結晶紫100 μL，室溫孵育1 min，再加入30%的乙酸脫色5 min，于595 nm波長下測吸光度值。同步設培養(yǎng)基對照孔、菌液對照孔。在培養(yǎng)基對照孔無生物膜形成和菌液對照孔有生物膜形成的情況下，分析判斷實驗孔結果。以OD值突然升高前的臨界值為藥物最小生物膜清除濃度（minimum biofilm eradication concentration，MBEC）。

3 結果

3.1 抗菌活性的測定結果

如圖1、圖2所示：與DMSO比較，小檗堿與氯霉素（陽性對照藥物）可顯著增加MRSA的抑菌環(huán)半徑（P<0.01）。小檗堿對MRSA的MIC為0.2 mg/mL；MBC為0.4 mg/mL。表明小檗堿對MRSA有比較明顯的抗菌、抑菌作用。

3.2 最小生物膜清除濃度（MBEC）的測定結果

如圖3所示：小檗堿對MRSA的MBEC為0.2 mg/

mL，表明小檗堿對MRSA生物膜的形成有比較明顯的抑制作用。

4 討論

小檗堿（berberine）是一種具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、降壓、降糖[5]等藥理作用的異喹啉生物堿，又稱黃連素，主要存在于小檗屬與黃連屬植物中，可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取。該藥對多種革蘭陽性菌（例如：溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎球菌等）、革蘭陰性菌（例如：痢疾桿菌、傷寒桿菌，腦膜炎球菌等）、抗酸桿菌（例如：結核分枝桿菌）、真菌（例如：白假絲酵母菌）具抑菌作用，廣泛用于胃腸炎、細菌性痢疾等治療，對肺結核、猩紅熱、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定療效。分析已有文件報道，筆者認為小檗堿的抑菌抗炎機制可能與下列因素有關[6-8]：（1）小檗堿能夠增強白細胞及肝網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，提高機體的抗菌能力；（2）小檗堿通過COX-1或結合型前列腺系E2合成酶-1（mPGES-1）的途徑影響PGE2 的生成，降低急性炎癥組織中PGE2 含量，提高機體抗炎作用；（3）小檗堿下調(diào)組織炎性因子TNF-α與COX-2的表達，改善組織病理變化與超微結構；（4）小檗堿抑制細菌、真菌等生物膜的形成，提高細胞膜的通透性及菌體對藥物的敏感性，改善機體抗菌作用。本研究結果表明：小檗堿對MRSA有明顯的抑菌與殺菌作用。

生物膜（biofilm）也稱生物被膜，是指附著于有生命或無生命物體表面、被細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體。其形成包括菌體起始粘附、生物膜發(fā)展和成熟擴散等階段。生物膜中存在各種生物大分子物質(zhì)（例如：蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、磷脂等）。由于生物膜的屏障作用，生物膜內(nèi)的細菌、真菌對臨床常用抗生素的敏感性顯著下降，生物膜內(nèi)的菌體比浮游菌更加耐藥。尋求抗生物膜的藥物對耐藥性細菌感染的防治更為重要。目前檢測生物膜的常用方法主要有96孔酶標板結晶紫法、顯微鏡觀察法和直接觀測法三種。96孔酶標板結晶紫法用于觀察靜置培養(yǎng)的細菌菌膜，是目前測量菌膜生成量最常用的方法。該方法的檢測原理是生物膜中的多糖與結晶紫結合而著色[9]。因此，通過測量乙酸脫色洗脫的生物膜的OD值來直接確定菌膜的形成量。本研究結果表明：小檗堿對MRSA生物膜形成有明顯的抑制作用，而且小檗堿對MRSA的MBEC與MIC均為0.2 mg/mL。

中藥的抗菌、抑菌機制復雜，小檗堿對MRSA的抗菌、抑菌作用可能與其抑制細菌生物膜的形成有關，但其影響生物膜形成的機制是什么？靶點又有哪些？有待進一步研究。

參考文獻：

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