任麗 黃銘娜 馮季靈 吳錫驊 蘇施雅

頸動(dòng)脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）與腦梗死的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，在CAS 研究中炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)占據(jù)著重要的地位[1-3]?？剐牧字贵w（anticardiolipin antibody，ACA）參與血管內(nèi)皮損傷，影響CAS 形成的多個(gè)環(huán)節(jié)[7-9]：ACA是腦梗死形成的危險(xiǎn)因素，被視為連接自身免疫反應(yīng)及凝血過(guò)程的關(guān)鍵橋梁[4-5]。目前，在國(guó)內(nèi)外血清ACA 濃度與患者CAS 相關(guān)性研究的報(bào)道很少[9]。本研究測(cè)定與細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能相關(guān)的血清ACA 的濃度及CAS 的生化指標(biāo)，進(jìn)而探究腦梗死患者的細(xì)胞免疫功能與體液免疫功能是否關(guān)聯(lián)。

資料與方法

一、一般資料

2016 年5 月～ 2017 年5 月期間收治的腦梗死患者120 例設(shè)為觀察組，觀察組患者按照腦梗死的面積分為輕癥組（大腦中動(dòng)脈區(qū)域腦梗，腦梗范圍的直徑≤5 cm 者，60 例）和中重癥組（大腦中動(dòng)脈區(qū)域腦梗，腦梗范圍的直徑＞5 cm 者，60 例）；選擇120 名健康體檢者設(shè)為對(duì)照組。對(duì)照組中男72 例、女48 例，年齡39～72 歲，平均（56.38±7.19）歲；觀察組中男76 例、女44 例，年齡12～73 歲，平均（57.27±7.5）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）18～73 歲；（2）經(jīng)MRl 確診為急性腦梗死；（3）首次發(fā)生腦梗死患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜18 歲；（2）患者及家屬拒絕簽署同意書(shū)；（3）伴腦部腫瘤性的疾??；（4）伴嚴(yán)重肝腎功能障礙；（5）伴先天性免疫性疾??；（6）妊娠或者哺乳期婦女。三組研究對(duì)象的性別、年齡分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且受試者均已簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

二、方法

（一）體液免疫指標(biāo)的測(cè)定

所有受試患者均于清晨8 點(diǎn)空腹，各取肘靜脈血3 ml，外周加入肝素-抗凝血?jiǎng)? ml 后使用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司流式細(xì)胞儀Coulter Epics XL 型）和速率散射免疫透射比濁法測(cè)定血球免疫球蛋白lgA，lgM 和lgG，以及補(bǔ)體C3和C4 免疫參數(shù)來(lái)反應(yīng)體液免疫，并嚴(yán)格按照各物質(zhì)含量及水平檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

（二）T 淋巴細(xì)胞免疫亞群指標(biāo)的測(cè)定

所有受試患者均于清晨8 點(diǎn)空腹，各取肘靜脈血3 ml，外周加入EDTA-抗凝血?jiǎng)? ml 后進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，采用Anti- CD3+-FITC、CD4+-PE 和CD8+-APC試劑盒分別檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞和CD4+/CD8+百分率水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法進(jìn)行測(cè)定（美國(guó)Dade-公司BN 100 型自動(dòng)特定蛋白分析儀和Dade-Behring 公司進(jìn)口的免疫球蛋白）采用流式細(xì)胞儀測(cè)定其中細(xì)胞免疫指標(biāo)，包括CD3+/CD8+含量水平。

（三）血清抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，ACA）測(cè)定

所有標(biāo)本均在1 周內(nèi)完成測(cè)定。采用ELISA定量法對(duì)血清ACA 水平進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品ACA 的濃度為橫坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制；樣品的ACA 含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得出相應(yīng)濃度。3 種標(biāo)準(zhǔn)ACA濃度依次為2、12和120 PLU/ml，12 PLU/ml為陽(yáng)性。采用ACA 試劑盒（上海艾研生物技術(shù)有限公司），anthos2010 多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行血清ACA 檢測(cè)。

（四）頸動(dòng)脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）生化指標(biāo)測(cè)定

所有標(biāo)本血樣分析采用美國(guó)進(jìn)口全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipopro-tein cholesterin，LDLC）的測(cè)定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，患者年齡、細(xì)胞免疫功能的情況、體液免疫的情況、ACA 濃度、CAS 常規(guī)生化指標(biāo)均采用±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析；患者性別比例為計(jì)數(shù)資料，采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；通過(guò)直線(xiàn)相關(guān)分析細(xì)胞免疫與體液免疫的相關(guān)性；以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的一般資料

三組研究對(duì)象的性別、年齡和病程等情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 研究對(duì)象的一般資料（±s）

表1 研究對(duì)象的一般資料（±s）

分組 例數(shù) 男/女 年齡（歲）對(duì)照組 120 72/48 56.38±7.19腦梗死輕癥組 60 38/22 57.27±7.50腦梗死中重癥組 60 35/25 57.95±8.22 χ2 / F 值 0.665 0.922 P 值 0.523 0.399

二、細(xì)胞免疫功能的情況測(cè)定結(jié)果

腦梗死中重癥組T 淋巴細(xì)胞含量低于腦梗死輕癥組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD8+細(xì)胞百分率（27.91%±2.97%）T 淋巴細(xì)胞含量高于腦梗死輕癥組和對(duì)照組，CD4+/CD8+比值（1.98±0.03）水平高于腦梗死輕癥組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與腦梗死輕癥組和對(duì)照組比較，腦梗死中重癥組NK 細(xì)胞（12.29% ± 1.58%）和B 細(xì)胞（12.76%±2.00%）均下降（P＜0.05）。（表2）

表2 各組研究對(duì)象細(xì)胞免疫的情況測(cè)定結(jié)果（±s）

表2 各組研究對(duì)象細(xì)胞免疫的情況測(cè)定結(jié)果（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與腦梗死輕癥組比較，bP＜0.05

分組 例數(shù) CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+ NK 細(xì)胞（%） B 細(xì)胞（%）對(duì)照組 120 56.33±8.21 39.81±4.10 21.66±5.17 0.84±0.11 27.45±2.13 19.71±3.16腦梗死輕癥組 60 40.03±4.16a 23.20±3.52a 24.75±2.15a 1.21±0.02a 15.81±1.12a 15.79±1.57a腦梗死中重癥組 60 45.22±5.53ab 28.11±4.09ab 27.91±2.97ab 1.98±0.03ab 12.29±1.58ab 12.76±2.00ab F 值 6.281 8.152 10.313 8.851 9.525 9.862 P 值 0.005 0.002 0.001 0.000 0.000 0.000

表3 各組研究對(duì)象體液免疫的情況測(cè)定結(jié)果（IU/ml，±s）

表3 各組研究對(duì)象體液免疫的情況測(cè)定結(jié)果（IU/ml，±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與腦梗死輕癥組比較，bP＜0.05

分組 例數(shù) IgG IgA IgM C3 C4對(duì)照組 120 14.12±1.33 2.81±0.19 2.11±0.05 1.64±0.01 0.29±0.01腦梗死輕癥組 60 12.11±1.52a 3.12±0.42a 2.25±0.02a 1.91±0.02a 0.34±0.02a腦梗死中重癥組 60 10.60±1.06ab 4.01±0.35ab 2.60±0.05ab 2.13±0.04ab 0.39±0.01ab F 值 7.258 13.102 5.213 8.808 7.253 P 值 0.015 0.002 0.025 0.003 0.007

表4 各組CAS 常規(guī)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（mmol/L，±s）

表4 各組CAS 常規(guī)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（mmol/L，±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與腦梗死輕癥組比較bP＜0.05

分組 例數(shù) TC TG HDLC LDLC對(duì)照組 120 1.21±0.02 1.06±0.02 0.97±0.03 0.67±0.02腦梗死輕癥組 60 1.52±0.01a 2.03±0.45a 0.45±0.04a 1.40±0.31a腦梗死中重癥組 60 1.75±0.03ab 2.42±0.33ab 0.36±0.02ab 1.55±0.21ab F 值 6.122 7.214 8.227 7.855 P 值 0.005 0.001 0.000 0.001

三、體液免疫的情況測(cè)定結(jié)果

與腦梗死輕癥組和對(duì)照組比較，腦梗死中重癥組血清中血球免疫球蛋白IgG（10.60±1.06）IU/ ml水平降低（P＜0.05）；血球免疫球蛋白IgA （4.01± 0.35）IU/ml、補(bǔ) 體C3（2.13±0.04）IU/ml 和 補(bǔ) 體C4（0.39±0.01）IU/ml 的水平升高（P＜0.05），而IgM（2.60±0.05）IU/ml 無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

四、ACA 濃度的測(cè)定結(jié)果

與腦梗死輕癥組（14.11±2.09）PLU/ml 和對(duì)照組（7.82±1.15）PLU/ml 比較，腦梗死中重癥組（16.88±2.50）PLU/ml 血清ACA 濃度提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.153，P＜0.01）。

五、CAS 常規(guī)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

與腦梗死輕癥組和對(duì)照組比較，腦梗死中重癥組總膽固醇[（1.75±0.03）mmol/L]和甘油三酯[（2.42±0.33）mmol/L] 含量增加；高密度脂蛋白膽固醇[（0.41±0.03）mmol/L]含量降低；與對(duì)照組比較，腦梗死中重癥組低密度脂蛋白膽固醇[（1.55±0.21）mmol/L]含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表4）

六、通過(guò)擬合回歸線(xiàn)分析細(xì)胞免疫與體液免疫的相關(guān)性

Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)結(jié)果的假設(shè)殘差顯正態(tài)性。通過(guò)細(xì)胞免疫參數(shù)與體液免疫參數(shù)之間的相關(guān)性分析顯示呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 各組研究對(duì)象細(xì)胞免疫與體液免疫的相關(guān)性分析結(jié)果

討 論

機(jī)體內(nèi)血小板的活化、凝血系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)的失衡，引起體液免疫和細(xì)胞免疫的功能變化，免疫球蛋白和補(bǔ)體是機(jī)體體液免疫狀態(tài)優(yōu)劣的比標(biāo)志物之一，且它們是體內(nèi)的非特異性免疫的主要指標(biāo)[11]。

本研究中，與對(duì)照組比較，腦梗死患者血清中血球免疫球蛋白IgG 水平降低；IgA、補(bǔ)體C3 和補(bǔ)體C4 的水平升高。外周血CD3+、CD4+、NK 細(xì)胞和B 細(xì)胞低于對(duì)照組；CD4+/CD8+比值水平提高。血清ACA濃度提高。本研究結(jié)果顯示腦梗死患者的細(xì)胞免疫功能與體液免疫功能的相關(guān)指標(biāo)存在直接相關(guān)的聯(lián)系。有研究表明CD4+/CD8+是目前臨床上最常用于機(jī)體細(xì)胞免疫功能的敏感性測(cè)定的指標(biāo)[12]。

患者血球免疫球蛋白lgA、lgM 和lgG 免疫參數(shù)，以及補(bǔ)體C3 和C4 變化水平不僅與凝血障礙有密切聯(lián)系，也是凝血因素中確定腦梗死發(fā)病的免疫因素[13]。補(bǔ)體C3、C4 可能是急性腦梗死的重要關(guān)鍵因素，大動(dòng)脈粥樣硬化性及隱源性腦卒中患者急性期血漿補(bǔ)體C3 水平持續(xù)升高，說(shuō)明補(bǔ)體激活與缺血再灌注損傷的潛在機(jī)制有很大的聯(lián)系。目前國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道與本結(jié)果有一定的異同。許多研究表明T 淋巴細(xì)胞為特異性群體，外周血的成熟T 細(xì)胞可分為CD3+、CD4+、CD8+等幾種亞群，其中CD4+T細(xì)胞主要識(shí)別MHC 呈遞的抗原，與遲發(fā)性巨噬細(xì)胞活化、NK 細(xì)胞和B 細(xì)胞的激活和胞內(nèi)病原體感染有密切聯(lián)系[14-16]。有研究也證明腦梗死患者的細(xì)胞免疫與體液免疫存在相關(guān)性[17]。在受到抗原刺激時(shí)，B 細(xì)胞會(huì)發(fā)生增殖、分化，開(kāi)始進(jìn)入激活狀態(tài)，并迅速分化，參與體液免疫應(yīng)答。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)的T 細(xì)胞比外周血中CD4+和CD8+細(xì)胞室中的T 細(xì)胞活化得多，CD4+T 細(xì)胞具有分化成輔助T 細(xì)胞各種亞型的能力[16-18]。在本研究中，腦梗死患者外周血中T 細(xì)胞亞群CD3+、CD4+及CD4+/CD8+含量低于健康對(duì)照人群，而CD8+含量則較健康對(duì)照人群升高，且這一差異隨著腦梗死患者疾病嚴(yán)重程度的增加而增加，再次證實(shí)體液免疫在急性腦梗死發(fā)生發(fā)展中的重要作用。大量研究證實(shí)，B 細(xì)胞在自身免疫疾病發(fā)生、發(fā)展中扮演致病的角色。最近對(duì)來(lái)自全基因組關(guān)聯(lián)研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析鑒定了B 細(xì)胞免疫應(yīng)答是冠心病等多種心腦血管疾病的致病因素[18-19]。CD19 是B 淋巴細(xì)胞表面的特異抗原，它從前B 淋巴細(xì)胞即開(kāi)始表達(dá)，一直到B 淋巴細(xì)胞的活化階段。CD19 抗原與B 淋巴細(xì)胞的激活有關(guān)。CD25 是膜表面含有IL-2 受體的淋巴細(xì)胞，CD19+CD25+淋巴細(xì)胞百分比反映了活化的B 淋巴細(xì)胞數(shù)量。

綜上所述，免疫功能參與了腦梗死的發(fā)生，發(fā)生腦梗死后，細(xì)胞免疫與體液免疫的相關(guān)指標(biāo)水平存在直接相關(guān)的聯(lián)系，通過(guò)檢測(cè)它們相關(guān)的生化指標(biāo)等標(biāo)志物反應(yīng)患者的免疫功能狀態(tài)，通過(guò)這些免疫指標(biāo)的檢測(cè)可以指導(dǎo)腦梗死治療和預(yù)后。