王文清 易文城 林擁華

臨床ICU 病房患者發(fā)生肺部等器官重癥感染時常引發(fā)全身炎癥反應和各器官組織低血流量灌注，其中擔負著物質代謝和內外分泌等多種功能的肝臟組織極易受到侵襲，而肝臟組織功能損傷可進一步加重全身炎癥反應，對患者搶救生存率帶來極大挑戰(zhàn)。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為革蘭氏陰性菌細胞壁表面成分，可誘發(fā)內毒素所致的急性肝損傷，LPS 能夠促進Toll 樣受體4（toll-like receptors，TLR4）表達，TLR4 可激活機體固有免疫系統(tǒng)，它在肝臟巨噬細胞上表達量最大，是導致肝臟組織損傷的重要環(huán)節(jié)[1]。本研究采用腹腔內注射LPS 誘導大鼠內毒素血癥模型，同時靜脈注射人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs），探索hUC-MSCs 對內毒素血癥誘導的大鼠急性肝損傷的保護作用及機制。

材料與方法

一、材料

1.hUC-MSCs：本研究選用第3～6 代細胞。剪取足月產婦臍帶基質組織塊，膠原酶Ⅳ消化，取懸液，離心、萃取、沉淀，胰蛋白酶消化，取細胞濾液，計數細胞，接種于不含血清低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)及傳代。

2.動物：4 周齡SD 雄性大鼠18 只（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），實驗動物置于清潔級、溫暖、安靜、濕度70%的動物飼養(yǎng)環(huán)境中，給予自由飲水和普通飼料喂養(yǎng)7 d。

3.主要試劑：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（美國Abcam 公司），GAPDH、JUN、ASK1、bcl-2 和Bax 抗體（美國CST 公司）。

二、方法

1.實驗動物分組及處理：SD 大鼠按照隨機數字表法分為對照組（C 組）、內毒素血癥組（M 組）和內毒素血癥+hUC-MSCs 治療組（M+cells 組），M 組和M+cells 組經腹腔注射LPS 誘導內毒素血癥模型，M+cells 組同時經尾靜脈注射20×106個hUC-MSCs 的100 μl 培養(yǎng)液。C 組經腹腔注射不含LPS 的等體積生理鹽水，C 組和M 組并同時經尾靜脈注射不含hUC-MSCs 的等體積生理鹽水。

2.觀察大鼠狀態(tài)，血清及肝臟組織標本的采集：密切觀察大鼠精神及活動狀態(tài)。各組大鼠干預4 h時處死，留取血清及肝臟組織，標本給予相應存儲。

3.肝功能和炎癥因子指標檢測：全自動生化儀檢測谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT），按照試劑盒說明書采用ELISA 法檢測TNF-α、IL-6。

4.HE 染色光鏡觀察大鼠肝臟組織形態(tài)改變：肝細胞形態(tài)、肝小葉結構、有無炎性細胞浸潤、肝細胞間隙是否可見Kuffer 細胞浸潤。

5.Western Blot 法檢測肝組織凋亡相關蛋白表達：取大鼠肝臟組織經PBS 清洗，組織裂解液提取總蛋白，聚丙烯酰胺瓊脂凝膠電泳，將蛋白質轉移至PVDF 膜，封閉后加抗體、抗抗體過夜。TBST 漂洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育，TBST 漂洗，加入ECL 暗室曝光，用Flour-s 凝膠系統(tǒng)分析蛋白條帶，蛋白的相對含量以目的蛋白吸光密度面積與GAPDH 條帶的比值表示。

三、統(tǒng)計學分析方法

運用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，肝功能和炎癥因子數據用±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，相關分析選用pearson。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、大鼠狀態(tài)觀察

正常組大鼠精神好，飲食及飲水正常，活動自如，呼吸平穩(wěn)，皮溫正常；內毒素血癥大鼠精神差，反應遲鈍，飲食及飲水量減少，活動減少，行動遲緩，呼吸急促，皮溫高；干細胞治療組大鼠精神狀態(tài)改善，反應比較靈敏，呼吸平穩(wěn)，皮溫基本正常。

二、大鼠肝功能和炎癥因子比較

與C 組比較，M 組和M+Cells 組AST、ALT、TNF-α、IL-6 濃度都升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與M組比較，M+Cells組的AST、ALT、TNF-α、IL-6 濃度降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

三、大鼠肝臟組織病理改變比較

C 組大鼠肝細胞形態(tài)正常，可見肝小葉結構清晰，肝匯管區(qū)無炎性細胞浸潤，M 組大鼠肝小葉散在點狀壞死肝細胞伴炎性浸潤，肝細胞間隙散布增生的Kuffer 細胞，M+Cells 組大鼠肝小葉炎性細胞浸潤及肝細胞間隙Kuffer 細胞浸潤明顯改善（圖1）。

表1 各組大鼠肝功能和炎癥因子比較（±s）

表1 各組大鼠肝功能和炎癥因子比較（±s）

注：與C 組比較，aP＜0.01；與M 組比較，bP＜0.01

分組 動物數（只） AST（U/L） ALT（U/L） TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）C 組 6 74.66± 6.39 40.07± 6.07 37.74±3.08 0.42±0.07 M 組 6 310.75± 9.13a 107.04±10.04a 160.32±4.88a 0.90±0.09a M+Cells 組 6 204.49±15.36ab 71.24± 7.34ab 117.61±9.37ab 0.60±0.10ab F 值 698.81 105.54 575.46 46.01 P 值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

圖1 光鏡下觀察大鼠肝臟組織病理改變比較（HE 染色，×200）

四、Western Blot 法免疫組化法檢測肝臟組織凋亡相關蛋白表達比較

與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織JUN、ASK1 和Bax 蛋白表達均增高（P 均＜0.05），Bcl-2蛋白降低（P＜0.05）；與模型組比較，干細胞治療組大鼠肝臟組織JUN、ASK1 和Bax 蛋白表達降低（P 均＜0.05），Bcl-2 蛋白增加（P＜0.05）（圖2，3）。

圖2 Western Blot 法免疫組化法檢測肝臟組織凋亡相關蛋白表達比較

圖3 Western Blot 法免疫組化法檢測肝臟組織凋亡相關蛋白表達比較

五、相關分析

單因素相關分析顯示大鼠血清ALT、AST 與TNF-α 指數呈正相關（r 值分別為0.9580、0.9865，P 均＜0.05），大鼠血清ALT、AST 與IL-6 指數呈正相關（r 值分別為0.9892、0.9630，P 均＜0.05），大鼠血清ALT、AST 分別與BAX、ASK1、JNK 指數均呈正相關（r 值分別為0.9993、0.9851、0.7901、0.9864、0.9557、0.7128，P 均＜0.05），大鼠血清ALT、AST 分別與BCL-2 指數均呈負相關（r 值分別為-0.8824、-0.9338，P 均＜0.05），大鼠血清TNF-α分別與BAX、ASK1、JNK 指數均呈正相關（r 值分別為0.9466、0.8958、0.6025，P 均＜0.05），大鼠血清TNF-α 與BCL-2 指數呈負相關（r=-0.6025，P 均＜0.05），大鼠血清IL-6 分別與BAX、ASK1、JNK 指數均呈正相關（r 值分別為0.9941、0.9997、0.8679，P 均＜0.05），大鼠血清IL-6 與BCL-2 指數呈負相關（r=-0.8078，P 均＜0.05）。

討 論

在LPS 誘發(fā)內毒素相關的急性肝損傷研究中，證實LPS 能夠促進TLR4 表達，TLR4 可激活機體固有免疫系統(tǒng)，促發(fā)細胞內一系列信號轉導通路，進一步加劇TNF-α 和IL-6 的轉錄與表達，引發(fā)級聯(lián)瀑布式炎癥反應，導致肝臟細胞功能漸進性損傷直至壞死。而敲除肝細胞TLR4 將可減輕肝臟功能損傷。文獻報道，腹腔注射LPS 誘發(fā)的大鼠急性肝損傷實驗中，在干預4 h 時肝組織受損最嚴重[2]。因此，本研究采用腹腔注射LPS 誘發(fā)的SD 大鼠急性肝損傷模型，與正常大鼠比較，模型大鼠血清AST 和ALT增加，TNF-α 和IL-6 亦增加。

已有基礎研究表明，間充質干細胞能夠通過減少免疫細胞浸潤和抑制促炎性細胞因子TNF-α、轉化生長因子-β1、IL-2 以及IL-10 等的表達和分泌，從而調節(jié)炎癥微環(huán)境，上調作為抗凋亡基因的bcl-2 表達來抑制細胞凋亡。TNF-α 和IL-6 亦可通過調節(jié)細胞循環(huán)并啟動肝細胞再生和提高肝細胞活力[3-5]。在四氯化碳（CCL4）誘導的小鼠急性肝損傷，或D-氨基半乳糖所致肝衰竭大鼠的研究中，均顯示了給予間充質干細胞干預可通過調節(jié)細胞周期蛋白D1 等的表達，來促進損傷的肝細胞重新進入新細胞周期的啟動階段、開始新細胞增殖周期而逆轉受損的肝臟組織[4]。此外，有體外研究表明間充質干細胞具有調節(jié)損傷的肝組織巨噬細胞的免疫抑制作用，以及抗纖維化作用而改善肝臟功能[3]。相關研究提示，間充質干細胞的治療作用主要與通過其分泌的各種細胞生長因子抑制炎癥[6-8]、保護竇內皮細胞和肝細胞避免凋亡、促進肝細胞再生及自噬等機制相關[9-10]。本研究對LPS 誘發(fā)的急性肝損傷SD 大鼠給予hUC-MSCs 干預，結果顯示干細胞治療組大鼠血清AST、ALT、TNF-α 和IL-6 濃度低。病理報告亦顯示：模型大鼠肝小葉散在點狀壞死肝細胞伴炎性浸潤，肝細胞間隙散布增生的Kuffer 細胞；而干細胞治療大鼠肝小葉炎性細胞浸潤及肝細胞間隙Kuffer 細胞浸潤改善，同時肝臟組織JUN、ASK1 和Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白增加。本組資料大鼠血清ALT、AST 與TNF-α 和IL-6 呈正相關，ALT、AST 與BAX、ASK1、JNK 均呈正相關而與BCL-2 指數均呈負相關。上述結果與文獻報道一致，提示hUC-MSCs 治療內毒素血癥大鼠急性肝功能損傷與其抑制炎癥反應和抑制肝細胞凋亡相關。

綜上所述，hUC-MSCs 具有減輕內毒素血癥大鼠急性肝功能損傷的作用，其機制與抑制炎癥反應和肝臟細胞凋亡通路相關。