陳津 付云烽 趙紅州 陳俊秋 程遠航 黃梁滸 朱凌峰 林娜 施小華 王水良 吳衛(wèi)真 譚建明

胰島功能完全衰竭的脆性糖尿?。╞ritlle diabetes），患者血糖水平極其不穩(wěn)定，頻繁出現(xiàn)酮癥酸中毒或嚴重低血糖等危及生命的并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。胰島移植是治療脆性糖尿病的最有效方法，通過胰島移植可以改善患者血糖水平，避免嚴重低血糖發(fā)生，提高C 肽水平[2]。雖然很多臨床研究證實了胰島移植的效果，但是胰島移植還存在許多障礙需要解決。目前胰島主要采用門靜脈肝內(nèi)移植的方式，移植的胰島在肝內(nèi)直接暴露于血液之中，承受非自然的機械壓力，可引起強烈的免疫排斥反應和炎癥反應，導致大量移植的胰島在移植初期就發(fā)生凋亡或失去功能，嚴重影響了胰島移植的治療效果[3]。構(gòu)建一個適合移植胰島生存的微環(huán)境，隔離胰島與血液的直接接觸，阻止血液系統(tǒng)的免疫細胞、抗體、補體等對胰島的攻擊，從而提高胰島的存活。

間充質(zhì)細胞（mesenchymal stroma cells，MSCs）是再生醫(yī)學重要的種子細胞，是許多微環(huán)境的重要組成成分。它能夠分泌多種細胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫和促進血管生成等屬性，在許多疾病的治療中呈現(xiàn)出令人振奮的治療效果[4-5]。聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）是一種有機硅材料，無毒無味，具有良好的生理惰性、化學穩(wěn)定性、生物相容性等優(yōu)點，廣泛的應用于藥品、化妝品、食品等各領(lǐng)域[6]。本研究通過PDMS 構(gòu)建支架，為胰島提供一個相對穩(wěn)定的物理空間，再聯(lián)合MSCs 和胞外基質(zhì)，構(gòu)建適合移植胰島生存的微環(huán)境，提高移植胰島的活性，并探討其在糖尿病大鼠的治療中的應用。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：SD 大鼠購自福州總醫(yī)院動物實驗中心，雄性，200～300 g。所有試驗在符合動物實驗倫理要求下進行。

2.主要試劑及儀器：PDMS（美國Dow Corning公司），分析純氯化鈉（中國國藥），凝血酶（湖南一格）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司）；膠原酶P（美國Sigma 公司）；Percoll（美國Pharmacia公司）；1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM-低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco 公司），細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶（美國Corning 公司），PE 標記抗小鼠單克隆抗體CD29，CD34，CD45，CD90（美國BD 公司），CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司），血糖試紙（德國Bayer 公司）。

二、方法

1.PDMS 支架構(gòu)建：分別用40 目和150 目篩網(wǎng)篩取顆粒大小為100～400 μm 的干燥NaCl 晶體，與PDMS 按取質(zhì)量比9 ：1 進行混合均勻后，倒入模具中，正向壓力1 000 PSI 壓縮固化4 h；將形成的支架從模具中取出，放入去離子蒸餾水中淘洗2 d，將NaCl 完全淘洗除去；然后將支架放入2 mol/L NaOH 中50 ℃孵育24 h；蒸餾水清洗3 次后，烘干，高溫高壓滅菌待用。

2.大鼠胰島分離及鑒定：按照筆者先前報道的方法[7]，大鼠麻醉下沿腹中線開腹，充分暴露腹腔；結(jié)扎靠近腸壁的胰膽管末端；分離肝下膽總管，頭皮針穿刺并固定。破心放血后，經(jīng)穿刺灌注膠原酶P 約10 ml，分離灌注好的胰腺，轉(zhuǎn)移入消化瓶中，37 ℃水浴消化10 min，充分振搖，加入5 ml 小牛血清終止消化；經(jīng)40 目濾網(wǎng)過濾后，行Percoll（11%，20%，23%，25%）不連續(xù)密度梯度離心純化胰島，獲得的胰島DTZ 染色鑒定純度，經(jīng)AO/PI 染色鑒定胰島活性。胰島培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)備用。

3.大鼠MSCs 分離培養(yǎng)及鑒定：按照先前報道的方法[7-8]，無菌條件下，分離獲取大鼠股骨和脛骨，沖洗出骨髓腔內(nèi)的骨髓，經(jīng)全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)，48 h 后棄去非貼壁血細胞，每2～3 天換液1 次。待細胞長至80%～ 90%融合時，用含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化傳代，經(jīng)流式鑒定間充質(zhì)細胞表面標志物的表達。

4.胰島微環(huán)境構(gòu)建：分別抽取大鼠促凝血和肝素抗凝血，分離獲得大鼠血清和血漿；將獲得的PDMS 支架用含10%大鼠血清的PBS 緩沖液浸泡過夜；然后將支架放入培養(yǎng)皿中，加入大鼠骨髓MSCs 的細胞懸液（2×106個/ml）培養(yǎng)過夜。取出含間充質(zhì)細胞的支架，放入新的培養(yǎng)皿中。將分離的SD 大鼠胰島濃縮于50 μl 的1640 培養(yǎng)基中。將胰島懸液裝載入支架中。取SD 大鼠血漿，按體積比10 ：1 加入凝血酶（2 000 IU/ml），混合均勻后，迅速滴加于支架外圍，形成一層包繞支架的纖維蛋白膠，即制備得到含有MSCs、胰島細胞、胞外基質(zhì)保護膜組成的移植胰島微環(huán)境——“人工胰腺”。

5.STZ 誘導糖尿病大鼠模型：按照先前報道的方法誘導SD 大鼠糖尿病模型[7]。腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg，2 d 后監(jiān)測大鼠血糖、體重，當連續(xù)監(jiān)測3 d 血糖＞300 mg/dl（16.6 mmol/L）為糖尿病模型。

6.“人工胰腺”移植：SD 大鼠在1%戊巴比妥鈉麻醉下，在腹部切開1 個小口，在胃大彎下找到大網(wǎng)膜，將大網(wǎng)膜鋪展開，并將“人工胰腺”裝載在大網(wǎng)膜上，用大網(wǎng)膜將其包裹，加入新鮮配制的纖維蛋白膠；將大網(wǎng)膜回納入腹腔后縫合大鼠肌肉和皮膚；假手術(shù)對照組按手術(shù)步驟行假手術(shù)不植入“人工胰腺”；術(shù)后分別對大鼠血糖情況進行監(jiān)測。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用Graphpad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析，血糖值以±s 表示，實驗組與假手術(shù)對照組血糖水平經(jīng)方差齊性分析，方差齊采用t 檢驗，方差不齊則采用曼-惠特尼U 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、PDMS 三維支架構(gòu)建結(jié)果

根據(jù)磨具不同生成不同的三維巨孔支架。NaCl 晶體被淘洗后，留下相應大小的孔洞。顯微鏡下可見大量不規(guī)則孔洞空間（圖1）。

二、大鼠胰島分離鑒定結(jié)果

經(jīng)酶消化和不連續(xù)密度梯度離心，可獲得較純的胰島，經(jīng)DTZ 染色，胰島呈猩紅色，腺泡細胞不染色。經(jīng)AO/PI 染色顯示，獲得的胰島活性＞90%（圖2）。

圖1 構(gòu)建PDMS 三維多孔支架結(jié)果

圖2 倒置相差顯微鏡觀察大鼠胰島分離純化鑒定結(jié)果

三、大鼠MSCs 分離鑒定結(jié)果

全骨髓法貼壁培養(yǎng)3 d 后，可見成纖維狀細胞小集落生成，擴增培養(yǎng)后可獲得較均一的成纖維樣，魚群狀細胞群（圖3）。經(jīng)流式鑒定表達CD29，CD90；不表達造血系統(tǒng)的標志物CD34，CD45 等（圖4）。

四、“人工胰腺”構(gòu)建結(jié)果

PDMS 支架裝載胰島后，顯微鏡下可見PDMS孔內(nèi)存在胰島。病理組化HE 染色結(jié)果顯示，胰島周圍存在明顯的瘦長型MSCs 包繞，而不含MSCs組對照未見有瘦長型細胞包繞。見圖5箭頭所示。

五、“人工胰腺”大網(wǎng)膜移植治療糖尿病大鼠結(jié)果

“人工胰腺”大網(wǎng)膜移植過程如圖6。移植前和移植后糖尿病大鼠血糖水平見表1。移植后“人工胰腺”移植組與假手術(shù)對照組相比血糖水平下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學意義（t=7.96、9.15、8.82，U=0.00，P 均＜0.01）。說明人工胰腺內(nèi)胰島，具有分泌胰島素，發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的作用。

圖3 倒置相差顯微鏡下觀察全骨髓貼壁培養(yǎng)獲得的大鼠MSCs 形態(tài)（×40）

圖4 大鼠骨髓MSCs 表面標志物表達流式鑒定結(jié)果

圖5 顯微鏡下觀察“人工胰腺”構(gòu)建結(jié)果

圖6 “人工胰腺”大網(wǎng)膜移植過程

表1 兩組糖尿病大鼠“人工胰腺”大網(wǎng)膜移植前后血糖水平（mg/dl，±s）

表1 兩組糖尿病大鼠“人工胰腺”大網(wǎng)膜移植前后血糖水平（mg/dl，±s）

注：*為U 值，血糖檢測值超出檢測上限的，定為650 mg/dl。移植前，移植后1，3，5 d 數(shù)據(jù)方差齊，采用t 檢驗，移植后7 d 數(shù)據(jù)方差不齊，采用曼-惠特尼U 檢驗

分 組 移植前 移植后1 d 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d“人工胰腺”移植組 568.20±27.93 278.70±86.06 323.50±44.29 283.30±74.00 304.80±13.33假手術(shù)對照組 566.00±47.63 606.00±52.40 589.70±55.78 615.00±54.84 630.30±48.17 t 值 0.10 7.96 9.15 8.82 0.00*P 值 0.9253＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

討 論

肝內(nèi)移植的微環(huán)境，并不是最適合胰島生存的移植位點[9]。研究者不斷嘗試不同的方法構(gòu)建一個類似“人工胰腺”的胰島移植微環(huán)境[10-11]。構(gòu)建“人工胰腺”微環(huán)境，需要解決幾個關(guān)鍵的問題[12-14]：（1）為胰島提供一個定植空間，保護胰島免受機械壓力損傷；（2）減輕胰島與血液直接接觸觸發(fā)的炎癥反應造成的損傷；（3）克服機體免疫細胞對胰島的免疫攻擊造成的損傷；（4）快速血管化，保障胰島的營養(yǎng)供應，使其在“人工胰腺”內(nèi)的長期存活。

為解決胰島定植空間問題，本研究利用PDMS與氯化鈉晶體結(jié)合固化，通過淘洗融化氯化鈉晶體后，形成含有大量孔洞的三維支架，可以為胰島提供物理存在的空間。該支架可耐受高溫高壓、酸堿等，具有較強的生物穩(wěn)定性。本研究在PDMS 支架中加入MSCs 作為支架微環(huán)境重要組成部分，并利用胞外基質(zhì)纖維蛋白，形成一層生物膠將胰島和MSCs 包裹于支架內(nèi)，與免疫細胞等進行隔離，形成一個迷你“人工胰腺”。MSCs 因其具有分化潛能、免疫調(diào)控、分泌細胞因子等功能成為再生醫(yī)學重要的種子細胞[4,15]。MSCs 也是胰腺間質(zhì)細胞的重要組成部分。先前的研究也證實，MSCs 在體內(nèi)外均能促進胰島的存活，MSCs 和胰島共移植可以減少移植受體所需的胰島量[7,16-17]。MSCs 可以調(diào)節(jié)免疫，減輕炎癥反應，促進胰島血管生成等[18-19]。此外胰腺基底膜含有多種胞外基質(zhì)蛋白如層粘連蛋白和膠原蛋白，可以通過β1 整合素受體支持β 細胞功能[20]。豐富的胞外基質(zhì)是移植胰島存活的必要條件，當胰島培養(yǎng)在ECM 蛋白中如纖維連接蛋白，膠原或?qū)诱尺B蛋白中，存活率增加[21-22]。甚至包括存在與許多ECM 分子中的RGD 序列都能通過降低胰島對凋亡的敏感性，提高胰島的存活[23]。

本研究將構(gòu)建的“人工胰腺”移植于糖尿病大鼠大網(wǎng)膜上，結(jié)果顯示，糖尿病大鼠血糖得到有效控制，說明構(gòu)建的“人工胰腺”可在體內(nèi)具有生物學功能。因此，MSCs 聯(lián)合PDMS 支架構(gòu)建的微環(huán)境，可為胰島移植提供生存的移植微環(huán)境，但其長期的效果和機制分析還有待于進一步的深入研究。