朱聰 黃國鋒 江惠祥 吳本文 林劍彪 林偉斌 高明明 丁真奇

大段骨缺損的治療是臨床上的一個難題[1]。自體骨移植是目前最常見的方法之一，但是存在供體骨有限，造成新的損傷等問題。組織工程骨（tissue engineered bone，TEB）移植是目前被認(rèn)為最有前景的替代治療方法[2]，其促進(jìn)骨缺損修復(fù)的效果已在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究中得到初步證實(shí)[3-4]。

生物體內(nèi)骨的生長與塑形受到機(jī)械應(yīng)力刺激的調(diào)控[5]，發(fā)生骨折或骨缺損時，局部應(yīng)力刺激環(huán)境的改變導(dǎo)致骨的修復(fù)受到影響。研究表明，對骨折或骨缺損部位施加適當(dāng)?shù)臋C(jī)械應(yīng)力刺激可有效促進(jìn)骨折愈合[6-7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，間歇性軸向壓應(yīng)力刺激可有效促進(jìn)骨折的愈合，并根據(jù)此原理研制出了叩擊式機(jī)械應(yīng)力刺激儀[8]，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該儀器產(chǎn)生的間歇性軸向壓應(yīng)力對骨折與骨缺損的愈合具有良好的促進(jìn)作用[8-10]。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種儲存于人體內(nèi)的多能干細(xì)胞，是TEB 最常用的種子細(xì)胞之一[11]。有研究表明，適當(dāng)?shù)膲簯?yīng)力可增強(qiáng)骨折部位MSCs 中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性及Ⅰ型膠原含量，促進(jìn)MSCs 及成骨細(xì)胞胞外基質(zhì)合成[12]，從而促進(jìn)骨折愈合；但在發(fā)生骨缺損時，這種間歇性軸向壓應(yīng)力通過何種途徑對骨缺損的修復(fù)產(chǎn)生干預(yù)尚不明確。由于MSCs 在骨損傷的修復(fù)中起到了關(guān)鍵作用，因此本實(shí)驗(yàn)就間歇性軸向壓應(yīng)力對TEB 種子細(xì)胞黏附、增殖和成骨分化能力的影響進(jìn)行探索，以求探明其機(jī)制。

材料和方法

一、主要材料

1.實(shí)驗(yàn)動物：清潔級新西蘭兔購自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

動物倫理聲明：本文中所有動物實(shí)驗(yàn)由廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院（中國人民解放軍第909 醫(yī)院）倫理委員會批準(zhǔn)，同時遵循國際醫(yī)學(xué)科學(xué)組織理事會頒布的《涉及動物的生物醫(yī)學(xué)研究的國際指導(dǎo)原則》。

2.試驗(yàn)試劑及耗材：兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rabbit bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs）分離液（天津?yàn)笊锟萍加邢薰荆?，DMEM/高糖培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素（美國Hyclone公司），胎牛血清（以色列Biological Industries 公司），胰蛋白酶（美國Sigma 公司），乙醚（廣東西隴化工股份有限公司），環(huán)氧乙烷（中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CD45 抗體（美國Acris Antibodies 公司），CD44 抗體（美國BD公司），CD34（美國Thermo Fisher公司），CD29 抗體（美國Millipore Corporation公司），山羊抗鼠二抗（江蘇聯(lián)科生物公司），攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）慢病毒（上海吉瑪公司），CCK-8（北京全式金公司），甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C（大連美侖公司）、ALP和Ca 結(jié)節(jié)染色試劑盒（北京雷根公司）。

3.主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱（美國REVCO公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman 公司），高端分選流式細(xì)胞儀（美國Beckman 公司），倒置生物顯微鏡（廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)儀（美國Amersham Biosciences 公司），叩擊式骨應(yīng)力刺激儀（中國專利號：CNl803117，廈門大博穎精醫(yī)療器械公司），場發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國卡爾·蔡司股份公司），活體熒光成祥系統(tǒng)（美國INDEC BioSystems 公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）。

二、方法

1.rBMSCs 的提取與分離：用無菌骨髓針從2個月大的新西蘭兔（800～1 200 g）髂骨中取5 ml紅骨髓，立即用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗混勻骨髓液，而后以250×g 離心10 min，收集底層沉淀，再用PBS 將細(xì)胞吹散調(diào)整至濃度為2×108～1×109/ml 備用。將5 ml rBMSCs 分離液加入15 ml 離心管，再將3 ml 上述細(xì)胞懸液小心加至分離液上層，以450×g 離心30 min，將單核細(xì)胞層收集至15 ml離心管，PBS 清洗2 遍，最后收集細(xì)胞于含有MSC完全培養(yǎng)基（DMEM/高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素）的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.rBMSCs表面分子的鑒定：將第三代（passage 3，P3）rBMSCs 調(diào)整至濃度為1×106/ml，而后按照說明書用CD45、CD44、CD34、CD29、山羊抗鼠二抗對其進(jìn)行熒光著色，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，用CytExpert 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.可穩(wěn)定表達(dá)GFP 的rBMSCs 的構(gòu)建：將P2代rBMSCs 濃度調(diào)整為1×105/ml，2 ml/孔種植于6 孔板，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后用MSC 完全培養(yǎng)基換液，添加攜帶GFP 基因的慢病毒（感染復(fù)數(shù)=100）放置原培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h 后棄去含病毒液培養(yǎng)基，加入MSCs 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3 d 后觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況并用高端分選流式細(xì)胞儀對其分選，留取高表達(dá)GFP 的細(xì)胞作為示蹤種子細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

4.TEB 的構(gòu)建：取6 個月大的小牛股骨頭松質(zhì)骨，將其切割成直徑8 mm、長15 mm 的圓柱體樣品，將樣品置入質(zhì)量百分比為20%過氧化氫中脫蛋白72 h（37℃下水浴箱孵育），再用乙醚循環(huán)脫脂48 h，制成有密集微孔的脫蛋白脫脂松質(zhì)骨支架（deproteinized and defatted cancellous bone scaffolds，DCBS），然后冷凍干燥，用環(huán)氧乙烷消毒后密封保存?zhèn)溆?。將P3 代穩(wěn)定表達(dá)GFP 的rBMSCs 濃度調(diào)整為3×105/ml，10 ml/管盛于15 ml 離心管中，放入一塊DCBS，運(yùn)用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)儀旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)參數(shù)為20 r/min，持續(xù)7 d。用倒置熒光顯微鏡及掃描電鏡觀察TEB 中rBMSCs 與DCBS 的相容性。

5.間歇性軸向壓應(yīng)力的添加：運(yùn)用叩擊式機(jī)械應(yīng)力刺激儀在第7～14 天對實(shí)驗(yàn)組施加大小10 N、頻率1 Hz、每次持續(xù)時間5 s、間隔時間3 s、4 h/d 的間歇性軸向壓應(yīng)力刺激（圖1）[9]，對照組常規(guī)培養(yǎng)無應(yīng)力刺激。

6.TEB 生長狀況的觀察：取應(yīng)力刺激組和非應(yīng)力刺激組TEB 分別放置于12 孔板中，每孔豎直放置一塊TEB 并做好標(biāo)記，加適量PBS 將支架充分浸潤，用活體熒光成像系統(tǒng)觀察并比較兩組熒光強(qiáng)度。再將兩組TEB 各切取5 mm×5 mm×5 mm 的組織塊，4%多聚甲醛固定3 h，然后用PBS 洗滌3次，乙醇溶液脫水，干燥后，用叔丁醇脫水固定4 ℃過夜，對樣品進(jìn)行包金和包膜。最后掃描電鏡觀察。細(xì)胞數(shù)/每500 倍視野被用來統(tǒng)計(jì)比較兩組種子細(xì)胞的生存狀態(tài)。

圖1 間歇性軸向壓應(yīng)力施加于TEB 的過程

7.種子細(xì)胞貼壁率的檢測：用0.25%的胰蛋白酶消化法分別獲取應(yīng)力刺激組與非應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞，將細(xì)胞按照80個/9 cm 培養(yǎng)皿比例分別種于12 皿9 cm 培養(yǎng)皿。每2 小時各取出一皿，觀察并計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞集落數(shù)），每一個單獨(dú)細(xì)胞集落計(jì)數(shù)為1 個貼壁細(xì)胞。細(xì)胞貼壁率=（貼壁細(xì)胞數(shù)/80）×100%。

8.種子細(xì)胞增殖能力檢測：用同上方法獲取兩組種子細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×104/ml，每孔100 μl種植于96孔板，放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。第24、48、72 和96 h，分別按10 μl/孔的量將CCK-8 試劑添加到相應(yīng)孔內(nèi)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h 后用酶標(biāo)儀檢測450 nm 的吸光度值（absorbance 450nm，A450）。

9.種子細(xì)胞成骨能力檢測：用同上方法獲取兩組種子細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml，2 ml/孔種植于6 孔板，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后棄去原培養(yǎng)基，每孔添加2 ml 預(yù)先配好的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含有10% FBS 的DMEM/高糖培基、10-2mol/L 甘油磷酸鈉、10-7mol/L 地塞米松、3×10-4mol/L 維生素 C），誘導(dǎo)培養(yǎng)基每2 天換液。而后按照說明書采用改良的鈣鈷染色法和茜素紅染色法對誘導(dǎo)形成的ALP 及Ca 結(jié)節(jié)進(jìn)行染色，采用Image Pro Plus 軟件計(jì)算染色陽性率（positive rate of dyeing，PRD），對兩組ALP 和Ca 結(jié)節(jié)的表達(dá)量進(jìn)行比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SUVmax數(shù)據(jù)用±s 表達(dá)。有無應(yīng)力刺激兩組間的SUVmax比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、倒置生物顯微鏡觀察及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示rBMSCs 被成功提取

倒置生物顯微鏡觀察顯示，剛生長出的rBMSCs 呈梭形、三角形或圓形，散在分布（圖2a），成熟的P3 代rBMSCs 呈梭形或流線型，緊密排列（圖 2b）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，提取的MSC高表達(dá)CD44、CD29 分子（＞95%），低表達(dá)CD45、CD34 分子（＜10%，圖3）。該結(jié)果證實(shí)rBMSCs 被成功提取分離。

二、倒置熒光顯微鏡和掃描電鏡結(jié)果顯示TEB中種子細(xì)胞與支架相容性良好

倒置熒光顯微鏡顯示，rBMSCs 被成功轉(zhuǎn)染導(dǎo)入GFP 基因從而表達(dá)GFP（圖4a），經(jīng)分選后GFP 的表達(dá)增強(qiáng)（圖4b）。掃描電鏡顯示，DCBS 為疏松多孔的結(jié)構(gòu)（圖4c）。在DCBS 與rBMSCs 通過旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)儀共培養(yǎng)后（圖4d），倒置熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察顯示rBMSCs 緊密黏附于DCBS上（圖4e、f），這表明種子細(xì)胞與支架相容性良好。

圖2 倒置生物顯微鏡下rBMSCs 的形態(tài)（×60）

三、活體熒光成像系統(tǒng)和掃描電鏡結(jié)果顯示應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞生存情況優(yōu)于非應(yīng)力刺激組

活體熒光成像系統(tǒng)結(jié)果顯示，非應(yīng)力刺激組TEB 的熒光強(qiáng)度要弱于應(yīng)力刺激組（圖5），對兩組平均熒光密度進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.90，P=0.04，表1），這表明應(yīng)力刺激組支架中種子細(xì)胞的生長狀況要優(yōu)于非應(yīng)力刺激組。掃描電鏡同樣顯示，應(yīng)力刺激組支架表面種子細(xì)胞的生長狀況要優(yōu)于非應(yīng)力刺激組（圖6），對兩組細(xì)胞個數(shù)/每500 倍鏡視野比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.14，P=0.01，表1）。

四、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞黏附能力強(qiáng)于非應(yīng)力刺激組

細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞在鋪板2 h 內(nèi)約一半以上細(xì)胞完成貼壁，在鋪板后10 h 內(nèi)，幾乎所有的細(xì)胞已完成貼壁；而非應(yīng)力刺激組在鋪板后2 h 內(nèi)只有近25%的細(xì)胞完成了貼壁，在鋪板后10 h 內(nèi)，也大概只有75%的細(xì)胞完成了貼壁。應(yīng)力刺激組75%細(xì)胞貼壁時間明顯短于非應(yīng)力刺激組，兩組時間分別為（3.00±0.41）h、（13.33±1.70）h，t=8.20，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且前者的最終細(xì)胞貼壁率高于后者（99.97%±0.34% vs 85.83%±1.18%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.31，P＜0.01，圖7）。

五、CCK-8 檢測結(jié)果顯示應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于非應(yīng)力刺激組

圖3 rBMSCs 的表面分子流式鑒定結(jié)果

表1 兩組種子細(xì)胞生存活性、增殖及成骨分化能力評估指標(biāo)比較（±s）

表1 兩組種子細(xì)胞生存活性、增殖及成骨分化能力評估指標(biāo)比較（±s）

分組 平均熒光密度 細(xì)胞數(shù)/每500 倍視野吸光度值 染色陽性率（%）48 h 72 h 96 h ALP Ca應(yīng)力刺激組 （3.75±0.34）×108 30.50±4.43 0.49±0.02 0.76±0.07 1.58±0.07 26.73±4.56 41.81±3.56非應(yīng)力刺激組 （2.92±0.22）×108 21.00±5.13 0.40±0.02 0.64±0.04 1.34±0.13 16.68±3.89 27.40±2.35 t 值 2.90 3.14 5.15 2.57 2.86 3.33 3.68 P 值 0.04 0.01＜0.05 0.04 0.03 0.03 0.02

圖4 示蹤種子細(xì)胞的構(gòu)建及TEB 的構(gòu)建與驗(yàn)證

圖5 活體熒光成像系統(tǒng)下非應(yīng)力刺激組與應(yīng)力刺激組TEB 培養(yǎng)1 周后熒光強(qiáng)度比較

CCK-8 檢測提示，在第24 小時，應(yīng)力刺激組與非應(yīng)力刺激組A450 無明顯差異，在而后的第48 小時到第96 小時，應(yīng)力刺激組A450 均高于非應(yīng)力刺激組，對兩者的A450 在第48、72 和96 小時分別進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.15、2.57、2.86，P 均＜0.05，表1）。且隨著時間延長，兩組A450 的差距越來越大（圖8）。這說明應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于非應(yīng)力刺激組。

六、成骨誘導(dǎo)染色結(jié)果顯示應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞成骨分化能力強(qiáng)于非應(yīng)力刺激組

在經(jīng)14 d 的成骨誘導(dǎo)后，對非應(yīng)力刺激組及應(yīng)力刺激組ALP 及Ca 結(jié)節(jié)進(jìn)行染色分析，結(jié)果顯示非應(yīng)力刺激組形成ALP 和Ca 結(jié)節(jié)均少于應(yīng)力刺激組（圖9，10），對兩組ALP 與Ca 結(jié)節(jié)的PRD 分別進(jìn)行比較（t=3.33、3.68，P 均＜0.05，表1），這說明在種子細(xì)胞的成骨分化能力方面，應(yīng)力刺激組要強(qiáng)于非應(yīng)力刺激組。

討 論

圖6 掃描電子顯微鏡下培養(yǎng)1 周后兩組種子細(xì)胞在TEB支架表面生存情況（×200）

圖7 非應(yīng)力刺激組與應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞貼壁率比較

前期研究發(fā)現(xiàn)，大小15 N、頻率1 Hz、4 h/d 的間歇性軸向壓應(yīng)力聯(lián)合DCBS 可促進(jìn)兔骨缺損的修復(fù)[9]，在本實(shí)驗(yàn)中，考慮支架直接受力缺乏軟組織的支撐作用，應(yīng)力大小被調(diào)整為10 N，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該應(yīng)力切實(shí)可行。其他學(xué)者也有用不同參數(shù)的周期性壓應(yīng)力進(jìn)行研究：Shigao 等[13]將大鼠成骨細(xì)胞植入Ⅰ型膠原海綿支架構(gòu)建TEB，對其施加正弦壓縮變形峰值為0.2%，頻率分別為0.2，2，10，20，40，60 Hz，3 min/d 的壓應(yīng)力連續(xù)14 d，發(fā)現(xiàn)該應(yīng)力可有效促進(jìn)種子細(xì)胞礦化成骨，且頻率為2 Hz 時效果最明顯；Liu 等[14]將產(chǎn)生10%彈性形變，頻率0.5 Hz，2 h/次，4 次/d，4 h/每間隔的周期性壓應(yīng)力施加于聚氨酯支架與人BMSCs 構(gòu)建的TEB，發(fā)現(xiàn)2 周后BMSCs 增殖能力增強(qiáng)；Ravichandran 等[15]對TEB施加生理應(yīng)變值為0.22%，頻率1 Hz，4 h/d，持續(xù)4 周的周期性壓應(yīng)力，發(fā)現(xiàn)該應(yīng)力可增強(qiáng)種子細(xì)胞的礦化成骨；他們得出的結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論相類似。盡管本實(shí)驗(yàn)證實(shí)大小10 N、頻率1 Hz、4 h/d 的周期性單軸向壓應(yīng)力對增強(qiáng)TEB 種子細(xì)胞的黏附增殖及成骨分化能力切實(shí)有效，但此參數(shù)是否為最適宜參數(shù)尚不確定。

圖8 非應(yīng)力刺激組與應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞在450 nm 波長處的吸光度值比較

圖9 倒置生物顯微鏡下非應(yīng)力刺激組與應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后ALP 染色結(jié)果（改良Gomori 鈣鈷法染色，×60）

圖10 倒置生物顯微鏡下非應(yīng)力刺激組與應(yīng)力刺激組種子細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后Ca 結(jié)節(jié)染色結(jié)果（茜素紅染色，×60）

也有研究表明，壓應(yīng)力刺激促進(jìn)骨損傷的修復(fù)主要是通過促進(jìn)MSCs 向軟骨分化間接實(shí)現(xiàn)的：Youngmee 等[16]利 用 聚L-丙交酯-己內(nèi)酯和rBMSCs 構(gòu)建TEB，對其施加產(chǎn)生5%彈性形變，頻率0.1 Hz，10 d 的壓應(yīng)力刺激，發(fā)現(xiàn)該應(yīng)力刺激可促進(jìn)rBMSCs 向軟骨細(xì)胞分化。這些結(jié)果上的差異可能與TEB 的構(gòu)建和應(yīng)力刺激參數(shù)及作用時間的長短不同有關(guān)。Brunellia 等[17]運(yùn)用聚已酸內(nèi)酯和細(xì)胞基質(zhì)類似物制造的支架與人類胚胎中胚層祖細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建TEB，對其施加產(chǎn)生5%彈性形變及1%彈性形變的周期性壓應(yīng)力，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)初期，循環(huán)載荷抑制了局部的礦物沉積；但在培養(yǎng)后期，循環(huán)載荷會誘導(dǎo)礦物的形成。這也說明了應(yīng)力刺激作用的時間不同其對TEB 產(chǎn)生的影響也不相同。

機(jī)械應(yīng)力刺激誘導(dǎo)MSCs 的成骨分化受到多種分子及多條信號通路的共同調(diào)控。有研究指出β- 連環(huán)蛋白，YAP 和MKL1-SRF 旁路途經(jīng)對于胞外應(yīng)力刺激向胞內(nèi)的起到了關(guān)鍵作用[18]。Chen 等[19]研究證實(shí)AMPK-SIRT1 旁路途經(jīng)在拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)MSCs 成骨分化過程中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。Song 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力刺激可通過PI3K/Akt/GSK-3β/β-連環(huán)蛋白旁路途經(jīng)促進(jìn)MSCs 的成骨分化。隨著研究深入，更多的調(diào)節(jié)因子及信號通路將被發(fā)現(xiàn)，但目前該種應(yīng)力刺激是通過何種分子機(jī)制促進(jìn)MSCs 向成骨分化尚不明確，仍有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了機(jī)械應(yīng)力刺激可促進(jìn)TEB 種子細(xì)胞的黏附增殖及成骨分化，結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種應(yīng)力刺激可能是通過增強(qiáng)TEB 中種子細(xì)胞的黏附能力、增殖能力及成骨分化能力從而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，這為臨床上將該種應(yīng)力刺激與TEB 相結(jié)合治療骨缺損提供了一定的理論依據(jù)。