陳泓穎 張宇航 高光敏 馮程 謝文麗

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）性炎癥是心血管疾病急性并發(fā)癥的主要原因[1-3]，他汀類藥物和血管緊張素轉換酶（angiotensin-converting，ACE）抑制劑，都具有抗炎特性[4-5]。細胞間黏附分子-1（intercellular adhesionmolecule-1，ICAM-1）和 血管細胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1），吸引淋巴細胞和單核細胞與內皮結合并浸潤動脈壁內膜介質層，低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）可加速AS 斑塊形成[6]。在內膜中單核細胞會向吞噬氧化型低密度脂蛋白沉積物的巨噬細胞分化，由于膽固醇流出物和氧化型低密度脂蛋白清除功能受損的影響進而轉化為泡沫細胞[7-8]。Zernecke 等[9]研究指出由于動脈區(qū)域受到異常剪切應力，導致內皮細胞微粒（endothelial microparticles，EMPs）的促炎癥激活。EMPs 是miR-19b 在血管內皮細胞和其他細胞之間的通訊中的重要載體[10-12]，本研究即探討miR-19b 在AS中對炎癥反應的影響。

材料與方法

一、實驗動物

SPF 級ApoE-/-小鼠（雄性，5 周，15～20 g）購自南京君科生物有限公司，根據動物保護和使用委員會的標準在無病原體條件下飼養(yǎng)。所有的實驗動物程序都符合動物護理和使用委員會的審查和批準。

二、方法

（一）建立AS 小鼠模型和分組

選取實驗組和對照組SPF 級5 周小鼠各50 只，體重16～25 g。（1）對照組：健康小鼠；（2）患有AS 小鼠模型組（AS 模型組）：使用高脂膽固醇飲食（1.25%膽固醇和21%脂肪）喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠；（3）NC-miRNA 組：尾靜脈注射miRNA 抑制劑構建AS 模型小鼠為陰性對照；（4）miRNA-19b 抑制劑組：構建AS 小鼠模型后尾靜脈注射miRNA-19b抑制劑，摘眼球取血，腹腔注射10%水合氯醛，處死后解剖取胸主動脈，置于4%多聚甲醛溶液中固定，進行病理染色，部分放于-80℃凍存，備用。

（二）觀測指標及方法

1.AS 病變的組織學評價：在光學顯微鏡下對組織進行觀察，使用相機對每張主動脈切片選一塊組織進行拍照，倍數拍照盡可能容納整塊斑痕表達，使用專業(yè)圖像處理軟件測量主動脈斷面面積、斑塊面積等，將測量出的斑塊面積除以計算所得的主動脈面積，則得出斑塊面積百分，并對各組的斑塊面積百分比進行統(tǒng)計、比較分析。

2.小鼠血脂水平檢測：取眼球血分離血清，離心機12 000×g 離心10 min，檢測血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 的生化指標。

3.ELISA 血管炎癥性因子濃度檢測：BCA 法測定提取的蛋白濃度。按照試劑盒說明書進行TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-10 ELISA 檢測，然后用酶標儀檢測各孔的光密度（OD）值。EzRIPA 裂解試劑盒裂解細胞（日本Tokyo 公司），使用線粒體分離試劑盒分離線粒體（美國西格瑪奧德里奇公司），均按照制造商的說明進行操作。使用Pierce BCA Protein Assay Reagent 試劑盒測定蛋白質濃度。在Laemmli 樣品緩沖液中裂解蛋白質，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到Immobilon-P Transfer Membrane 過濾器（美國西格瑪奧德里奇公司）上。

4.Western Blot 檢測小鼠血管組織中相關蛋白表達變化：取適量動脈組織樣品置于1～2 ml 勻漿器中球狀部位，組織塊盡量剪碎后加400 μl 單去污劑裂解液（含PMSF）進行勻漿，重復幾次使組織盡量破碎。裂解30 min 后，在4 ℃下12 000×g 離心5 min，取上清液進行BCA 檢測蛋白濃度；加入一抗（1：200），搖床震蕩2 h；用TBST 在室溫下脫色搖床上洗2 次，每次10 min；再用TBS 洗1 次，10 min，二抗孵育2 h，用0.01 mol/L PBS 洗膜3 次，ECL 底物發(fā)光表示蛋白的相對表達量。

5.實時熒光定量PCR 檢測miR-19b 表達及細胞凋亡實驗：取液氮保存中的主動脈組織于預冷研缽內，使其一直處于液氮中研磨，最后用勺子收集粉末，放入加入1 ml trizol 的1.5 ml 無酶離心管中，混勻測定總RNA 濃度及純度，采用miR-19b 特異性逆轉錄引物及逆轉錄試劑盒合成cDNA（上海生工工程有限公司），隨后以cDNA 為模版進行real-timePCR 反應，PCR 儀設置條件為37 ℃保持15 min、85 ℃保持5 s、4 ℃至最終。取各組動脈組織檢測細胞的凋亡情況，根據Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒進行檢測。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件，胸腔動脈斑塊面積百分比、血脂的相關性指標、血管炎癥性因子的表達水平、血管組織中凋亡因子Bcl-2、cleaved- caspase-3 和Bax 的表達水平、各組模型中miRNA-19b 的轉錄水平以及各組巨噬細胞的凋亡率采用±s 表示，首先進行正態(tài)性分析，若符合正態(tài)性分布則多組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、AS 病變的組織學比較

對照組小鼠內皮細胞排列整齊，NC-miRNA 組和AS 模型組小鼠血管內皮細胞的排列較亂，內膜厚度增加，miRNA-19b 抑制劑組的小鼠組織病變程度大大減輕。小鼠的主動脈斑塊面積百分比比較分析發(fā)現，對照組小鼠主動脈檢測出粥樣斑塊為無，其它各組小鼠主動脈粥樣斑塊面積百分比大小順序分別為：AS 模型組＞NC-miRNA 組＞miRNA- 19b抑制劑組，四組具體斑塊面積比數值見表1。miRNA-19b 抑制劑組低于模型組，NC- miRNA 組與AS 模型組差異具有統(tǒng)計學意義，但存在降低趨勢。各組胸腔動脈斑塊面積百分比：對照組為（0.00±0.00）%；AS模型組為（9.59±6.53）%；NC-miRNA 組為（8.96±3.47）%；miRNA-19b 抑制劑組為（3.21±2.03）%，三組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=20.572，P=0.002）。（圖1）

二、血脂相關指標檢測對比

與對照組比較，AS 模型組和NC-miRNA 組 TC、TG 和LDL-C 水平升高，而HDL-C 水平含量降低；與AS 模型組比較miRNA-19b 抑制劑組TC、TG 和LDL-C 水平降低，HDL-C 水平則有升高，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05，表1）。

三、血管炎癥性因子的表達水平的變化結果

AS模型組與對照組相比，IL-1（34.06± 3.58）g/ L、IL-6（92.57±31.97）g/L 和TNF-α（63.01± 15.65）g/L 水平升高，而IL-10（16.86± 1.29）g/L 的水平降低，NC-miRNA 組各指標也有相同的變化趨勢；miRNA-19b 抑制劑組IL-1、IL-6 和TNF-α 水平低于AS 模型組和NC- miRNA 組，IL-10 的水平則高于兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05，表2）。

圖1 倒置光學顯微下觀察動脈血管組織病理變化 （Oil-red 染色，×600）

四、血管組織中凋亡因子Bcl-2、cleaved- caspase-3 和Bax 的表達水平

NC-miRNA、AS模型組的Bax和cleaved- PARP 表達量升高，但Bcl-2 表達水平下調，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與NC-miRNA 組相比，miRNA-19b 抑制劑組的促細胞凋亡的蛋白Bax 和cleaved-PARP 表達水平下調，Bcl-2 的表達水平上調。（圖2、表3）

五、各組模型中miRNA-19b 的轉錄水平

圖2 Western Blot 檢測BCL-2、cleaved-PARP 以及Bax 表達

與對照組比較，AS模型組（2.71±0.02）和NC- miRNA 組（2.43±0.02）的miRNA-19b的轉錄水平增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miRNA-19b 抑制劑組（1.52±0.01）轉錄水平有升高，但相較于AS 模型組和NC-miRNA 組的變化其增加量不顯著。miRNA-19b 基因轉錄水平：對照 組 為1.02±0.03；AS 模 型 組 為2.71±0.02；NC- miRNA 組為2.43±0.02；miRNA-19b 抑制劑組為1.52±0.01，4 組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=15.353，P=0.002）。（圖3）

表1 血脂相關性指標的水平測定結果（mmol/L，±s）

表1 血脂相關性指標的水平測定結果（mmol/L，±s）

注：與對照組比較aP＜0.05，與AS 模型組比較bP＜0.05

分組 動物數（只） TC TG HDL-C LDL-C對照組 50 0.79±0.16 0.09±0.02 0.31±0.08 0.35±0.23 AS 模型組 50 3.26±0.21a 0.25±0.06a 0.08±0.09a 1.65±0.11a NC-miRNA 組 50 3.13±0.14ab 0.21±0.02ab 0.08±0.05ab 1.59±0.27ab miRNA-19b 抑制劑組 50 1.85±0.06ab 0.15±0.03ab 0.11±0.05ab 1.21±0.10ab F 值 13.994 11.230 10.069 12.450 P 值 0.002 0.011 0.006 0.004

表2 各組小鼠血清IL-1、IL-6 IL-10 和 TNF-α 含量比較（g/L，±s）

表2 各組小鼠血清IL-1、IL-6 IL-10 和 TNF-α 含量比較（g/L，±s）

注：與對照組比較aP＜0.05，與AS 模型組比較bP＜0.05

分組 動物數（只） IL-1 IL-6 IL-10 TNF-α對照組 50 23.51±5.01 45.23± 7.36 25.64±5.33 32.29± 5.39 AS 模型組 50 34.06±3.58a 92.57±31.97a 16.86±1.29a 63.01±15.65a NC-miRNA 組 50 33.56±4.59ab 89.26±21.07ab 17.34±1.53ab 60.91± 7.61ab miRNA-19b 抑制劑組 50 24.85±6.21ab 53.29±17.15ab 24.94±4.72ab 34.51± 6.47ab F 值 13.671 17.592 13.675 20.362 P 值 0.002 0.005 0.008 0.000

表3 BCL-2、cleaved-PARP 以及Bax 的蛋白相對表達量（±s）

表3 BCL-2、cleaved-PARP 以及Bax 的蛋白相對表達量（±s）

注：與對照組比較aP＜0.05，與AS 模型組比較bP＜0.05

分組 動物數（只） BCL-2 cleaved-PARP Bax對照組 50 1.21±0.03 1.35±0.05 1.04±0.01 AS 模型組 50 0.67±0.02a 2.47±0.05a 3.39±0.01a NC-miRNA 組 50 0.64±0.02ab 2.53±0.04ab 3.27±0.01ab miRNA-19b 抑制劑組 50 1.05±0.01ab 1.91±0.04ab 2.16±0.02ab F 值 12.585 13.226 26.910 P 值 0.013 0.009 0.000

圖3 miRNA-19b 基因轉錄水平

六、各組巨噬細胞的凋亡率檢測結果分析

流式細胞術法分別檢測了巨噬細胞的凋亡率變化，其結果如表5所示，與對照組比較，AS 模型組和NC-miRNA 組細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；miRNA-19b 抑制劑組細胞凋亡率低于AS 模型組，高于對照組。細胞凋亡率：對照組為（4.41±0.18）%；AS 模型組為（7.16±0.73）%；NC-miRNA 組為（6.29±0.24）%；miRNA-19b 抑制劑組為（5.01±0.11）%，4 組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=12.889，P=0.008）。

討 論

在AS 進程中，免疫和非免疫的血管細胞會釋放多種促炎信使，包括細胞因子、趨化因子、生物活性脂類化合物和黏附分子，這些分子可以維持和增強局部炎癥和AS 病變的發(fā)展[11]。AS 是一種慢性疾病，導致心力衰竭和死亡的最主要原因，AS 的病理生理機制包括脂質代謝紊亂、慢性炎癥血管和血細胞中促炎信號通路的上調促進了AS 的發(fā)生，炎癥在AS 所有階段的重要作用目前已為人所知，目前研究主要關注一些關鍵的促炎調節(jié)劑在AS 過程中的作用，如IL-1，IL- 6，TNF-α 和IFN-γ 等關鍵因素促炎細胞因子[12]。Qamar 等[13]臨床研究中發(fā)現，IL-1 在抑制治療慢性炎性疾病方面有有利的效果，潛在的暗示IL-1 作為抗炎治療AS 的目標，炎癥涉及多種難以靶向治療的調節(jié)和補償機制，抑制這些細胞因子的過度血管生成可能對抗炎治療AS 具有重要的治療意義。

本研究表明抑制miRNA-19b 可改善內皮細胞損傷，緩解由于AS 引起血管厚度的增加，減少AS斑塊的面積比例，與本文結果類似，Souilhol 等[14]研究同樣表明miRNA- 19b 與AS 發(fā)展具有相關性，miRNA-19b 抑制劑組血脂指標TC、TG 和LDL-C水平降低，HDL-C 水平則有升高，可以解釋抑制小鼠體內的miRNA-19b 可以緩解AS。Pirillo 等[15]研究表明miRNA-19b 能夠減少吞噬免疫細胞的凋亡率，相關蛋白的表達量變化檢測亦支持該結果。miRNA- 19b 經抑制后，可作為細胞凋亡的標志蛋白Bax 和cleaved-PARP 的表達量下降，同時具有抑制細胞凋亡作用的相關蛋白Bcl-2 的表達量上升。Naugler 等[16]研究表明IL-6 是急性炎癥的關鍵介質，在此期間其水平升高，其可視為炎性生物標志物，IL-6 是由巨噬細胞和T 細胞在感染或損傷后的最初階段產生，以誘導免疫反應和炎癥，VSMCs 也會分泌IL-6 來應對炎癥刺激和損傷，因為這種細胞因子是這種細胞類型的有絲分裂因子，IL-1產生的促炎癥細胞因子[17]，廣泛激活巨噬細胞。Canakinumab 等[18]的初步臨床試驗人類IL-1βspecific 單克隆抗體，其結果展示出了IL-1 在急性心肌梗死，中風和AS 等疾病中的療效。TNF-α 是一個有效的促炎細胞因子，主要在巨噬細胞和參與系統(tǒng)性炎癥和傳播的急性期反應[19-20]，TNF-α 有不同的免疫調節(jié)功能，如抑制病毒復制和致癌作用，誘導細胞凋亡和炎癥，啟動防御反應對膿毒癥等[21]，生產過剩的TNF-α 與急性和慢性炎癥有關，會對免疫介導的組織產生破壞，因此抑制這些細胞因子的過度血管生成可能對抗炎治療AS 具有重要的治療意義。本研究結果中通過抑制miRNA-19 導致IL-1、IL-6 和TNF-α 水平降低，IL- 10 的水平升高，表明抑制miRNA-19b 基因可以下調促炎因子，同時上調抗炎因子表達，減輕AS 小鼠動脈血管組織中的炎癥反應。Sun 等[22]認為，抑制miRNA- 19b可調節(jié)巨噬細胞的增殖凋亡，從而抑制AS 的發(fā)展進程。miRNA-19b 微粒廣泛存在于血液、組織和細胞中，與機體多種病理生理過程有關。MicroRNAs（miRNAs）是一種內源性的、長度為19-25 個核苷酸的非編碼RNA，在細胞間的相互作用中起著至關重要的作用，關于miRNA 的研究已經成為生命科學領域研究的熱點，miRNAs 與人類多種疾病密切相關。

綜上所述，miRNA-19b 抑制劑可以減少巨噬細胞的凋亡，降低促炎癥因子，可減少由于AS 引起血管厚度的增加，減少AS 斑塊的面積比例，使血脂中的TC、TG 和 LDL-C 水平降低，HDL-C 水平則有升高，這對冠心病的臨床診療具有重要的臨床指導意義。