張勝行 張曄智 陳立典

缺血性腦卒中是一種有較高病死率和致殘率的疾病，其高致死率和高致殘率與腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）密切相關(guān)[1]。細胞凋亡在CIRI 中施展了重要作用，凋亡的產(chǎn)生既是相關(guān)基因表達的結(jié)果，又受很多內(nèi)外因素的影響。神經(jīng)調(diào)節(jié)素（neuregulins，NRG）是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。ErbB（v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogenehomolog）是一種表皮生長因子受體，該受體可與NRG 結(jié)合而活化，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的神經(jīng)元遷移和分化，神經(jīng)突觸生長以及突觸形成等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，此外，還參與促進神經(jīng)環(huán)路和神經(jīng)元髓鞘形成、抑制神經(jīng)細胞凋亡、減少炎癥因子表達和調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達等來保護神經(jīng)系統(tǒng)，在CIRI 中起著關(guān)鍵作用[2]。NRG-1/ErbB4 雖然是一條與CIRI 密切相關(guān)的分子信號通路，但其與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系上缺乏系統(tǒng)的研究。因此，深入研究電針干預(yù)對CIRI 神經(jīng)元凋亡與NRG-1/ErbB4 通路的關(guān)系有重要的意義。

一、NRG-1/ErbB4 信號通路

（一）神經(jīng)調(diào)節(jié)素NRG

神經(jīng)調(diào)節(jié)素（NRG）是由六種基因編碼的多肽家族，包括NRG-1、NRG-2、NRG-3、NRG-4、NRG-5 和NRG-6 六種同源異構(gòu)體，這六種同源異構(gòu)體結(jié)構(gòu)差異較大，但是，它們都具有激活受體活性的表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣結(jié)構(gòu)域[3]。

Neuregulin-1（NRG-1）近年來受到越來越多研究者的關(guān)注。NRG-1 是一種內(nèi)源性生長因子，其編碼基因位于第8號染色體的短臂上，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著多種生物學(xué)效應(yīng)。根據(jù)剪切位點不同，其編碼產(chǎn)物有30 多種亞型[5]。NRG-1有著較為復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生大量組織及細胞特異性的亞基，負責(zé)轉(zhuǎn)錄二十余種跨膜蛋白。根據(jù)其氨基末端序列，可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型；而根據(jù)表皮生長因子樣基團的不同，可分為α 或β 型。

NRG-1 含有EGF 樣核心基團，發(fā)揮神經(jīng)元遷移、軸突生長、髓鞘和突觸的形成等作用。通過多種實驗動物模型，人們已證實NRG-1 對多種腦血管疾病發(fā)揮神經(jīng)保護作用，如缺血性腦血管病、癲癇、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化和精神分裂癥等。目前，NRG-1 已成為臨床上治療心力衰竭的三期臨床試驗用藥。缺血再灌注損傷時，NRG-1 對大腦、脊髓、心臟等器官功能恢復(fù)起著關(guān)鍵作用，通過促進神經(jīng)細胞分化、神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖、乙酰膽堿受體聚集而發(fā)揮器官保護作用[5]。相對NRG-1，其他5 種NRGs 的功能仍不清楚。

NRG-1包括神經(jīng)分化因子（neu differentiation factor，NDF）、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（heregulins，HRGs）、乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性因子（acetylcholine receptor inducing activity，ARIA）、膠質(zhì)細胞生長因子（glial growth factor，GGFs）、運動和感覺神經(jīng)元衍生因子（motor and sensory neuron-derived factor，MSNDF）等[6]。NRG-1 作為一種內(nèi)源性生長因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮多種功效。

（二）NRG-1 的受體ErbB4

ErbB 屬于表皮生長因子家族，由胞外結(jié)構(gòu)域、表皮結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成，是受體酪氨酸蛋白激酶家族的一員[7]。它由2 個富含半胱氨酸的基團、1 個細胞外氨基末端、1 個跨膜基團、1 個短小細胞內(nèi)酪氨酸激酶基團和一個尾部的羧基末端共同組成，其中，含半胱氨酸的基團具有主要受體結(jié)合功能。NRG-1/ErbB 通路在細胞的增殖分化以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生命過程中起著關(guān)鍵作用，與神經(jīng)發(fā)育異常疾病、心力衰竭、心肌梗死以及癌癥等疾病密切相關(guān)。ErbBs 受體包含有四種亞型：ErbB1，ErbB2、ErbB3、ErbB4。ErbB 蛋白與EGF 受體（EGFR，也叫ErbB1）具有同源性。

NRG信號主要通過ErbB2～ErbB4傳導(dǎo)，但是由于ErbB2 缺少胞外配體結(jié)合域，因此ErbB2 必須與結(jié)合有配體的其他ErbB 形成異二聚體（例如ErbB2-ErbB3，ErbB2- ErbB4，ErbB3-ErbB4），起著共受體的作用；ErbB3 缺少胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，故ErbB3 激酶不具有活性，雖然ErbB3能夠與NRG-1 相結(jié)合，但其同源二聚體（例如ErbB3-ErbB4）不具備催化活性；只有ErbB4 既有與受體結(jié)合的能力，同時也帶有激酶功能，因此ErbB4 是四種亞型中唯一有自主NRG-1 特異性的受體。ErbB4 可以與配體產(chǎn)生相互作用，同時還可以作為酪氨酸激酶被配體活化。所有ErbB 蛋白中，ErbB4 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中的功能是了解得最清楚的[8]。

（三）NRG-1/ErbB4 信號通路

NRG-1 的信號主要由ErbB1、ErbB2、ErbB3 和ErbB4這4 個ErbB 酪氨酸激酶家族受體傳遞，該通路即稱之為NRG-1/ErbB 信號傳導(dǎo)通路。NRG-1/ErbB 信號通路對胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和出生后嬰幼兒腦功能發(fā)育十分重要。NRG-1 與ErbB4 受體結(jié)合形成同型或異性二聚體后，激活內(nèi)源性酪氨酸激酶，受體磷酸化后，激活下游的多種信號通路，如絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、細胞周期依賴性蛋白激酶5（cyclindependent kinase 5，CDK5）和JAK 激酶（janus kinase）等（圖1），從而調(diào)控基因表達和蛋白質(zhì)翻譯。此外，ErbB 蛋白胞內(nèi)段經(jīng)水解后可直接入核參與調(diào)節(jié)基因表達[9]。

圖1 NRG1-ErbB4 信號通路

通過一項針對小鼠腦發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦發(fā)育階段，ErbB4 mRNA 最早在E9 被監(jiān)測到，大部分位于后腦和前腦；而隨著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，ErbB4 分布范圍逐漸擴大到全腦和脊髓內(nèi)。NRG-1/ErbB4 作用于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多種生理過程，十分廣泛，包括神經(jīng)元遷移、軸突成熟、興奮性神經(jīng)元上抑制性突觸的形成等。

有研究認為，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ErbB4 主要通過中間神經(jīng)元表達而非錐體細胞[10]。Law 等[11-12]對前腦和海馬中間神經(jīng)元進行了深入的興奮性突觸發(fā)育機制研究，發(fā)現(xiàn)NRG-1 的在體過表達可使海馬中間神經(jīng)元胞體興奮性突觸上調(diào)，而敲除NRG-1 后未見ErbB4 上調(diào)現(xiàn)象，而通過腹腔注射外源性NRG-1，同樣可觀察到額葉皮層中間神經(jīng)元的興奮性突觸有所增加[13]。結(jié)合前述實驗結(jié)果，可推測ErbB4 可能通過酪氨酸激酶域激活PI3K，ERK，JNK 和（或）CDK5 等信號通路促進AMPA 受體和NMDA 受體在中間神經(jīng)元谷氨酸能突觸后膜上的表達[14]，從而在突觸的形成過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用（圖2）。

圖2 ErbB4 參與中間神經(jīng)元信號調(diào)控

（四）NRG-1 的臨床應(yīng)用探索

近年來，已有多例關(guān)于精神分裂癥和阿爾茨海默病的研究發(fā)現(xiàn)，這些神經(jīng)疾病的發(fā)病機制與髓鞘化異常相關(guān)[15]。例如，NRG-1 被認為是精神分裂癥的易感基因，其基因變異與精神分裂癥密切相關(guān)；也有研究在精神分裂癥患者前腦皮質(zhì)中觀察到ErbB3 受體缺陷的現(xiàn)象，由此推測NRG-1 信號通路參與了精神分裂癥發(fā)生發(fā)展的機制[16]。而在阿爾茨海默癥模型實驗中也發(fā)現(xiàn)，NRG-1 和部分腦區(qū)ErbB4 表達上調(diào)，可通過抑制由藥物誘導(dǎo)的長時程增強，起到劑量依賴性的保護作用，當阻斷NRG-1/ErbB4 信號通路時，NRG-1 的保護作用則消失[17-18]。這些針對阿爾茨海默癥與NRG-1/ErbB4 信號通路的研究，為闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的細胞機制提供了新的思路，同時為創(chuàng)新治療方案提供了干預(yù)靶點。

在一些合成NRG-1 研究中也觀察到了NRG-1 促進神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。Zhang 等[19]的脊髓半切綜合征模型研究發(fā)現(xiàn)，外源輸注了NRG-1 的雪旺細胞移植的軸突髓鞘增加和后肢功能恢復(fù)均明顯優(yōu)于單純的雪旺細胞移植。也有研究指出，在損傷的坐骨神經(jīng)中使用合成有NRG-1 的生物材料，可上調(diào)生物材料ErbB2/ErbB3 受體表達，使軸突沿生物材料定向生長，募集雪旺細胞，發(fā)揮神經(jīng)定向修復(fù)作用[20]；Geuna 等[21]開展了針對大鼠前肢正中屈指肌肉的去神經(jīng)切斷術(shù)研究，大鼠去神經(jīng)切斷術(shù)后可見NRG-1 及其受體表達上調(diào)，而經(jīng)過神經(jīng)及肌肉人工移植修復(fù)后NRG-1 及其受體則有相反的表達趨勢，提示NRG-1 對于失神經(jīng)性肌肉萎縮癥也可能發(fā)揮治療作用。Audisio 等[22]通過研究NRG-1 和神經(jīng)生長因子對損傷的大鼠背根神經(jīng)節(jié)的作用，發(fā)現(xiàn)NRG-1 可增加軸突生長長度，而神經(jīng)生長因子可增加軸突數(shù)量。上述前期研究結(jié)果揭示了NRG-1 及其信號傳導(dǎo)通路或?qū)⒊蔀榕R床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)損傷的重要干預(yù)靶點，NRG-1 及其下游通路的研究與應(yīng)用具有廣闊的應(yīng)用前景。

二、CIRI 與細胞凋亡

缺血再灌注損傷是以細胞凋亡為主要損傷形式的一種常見、復(fù)雜的病理生理過程。通過觀察缺血性腦血管疾病發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)此類疾病的進展可見細胞凋亡，而細胞凋亡主要是一種涉及多因素調(diào)控的、發(fā)生在缺血程度較輕的半暗影區(qū)的、復(fù)雜的主動死亡過程，在神經(jīng)元的功能損害中發(fā)揮重要作用[23]。目前世界上主要主要圍繞Caspase-3、NF-κB、Bcl-2/Bax、P21 等因子，從多個角度研究這些因素參與CIRI后的細胞凋亡機制。

（一）Caspase-3 與與細胞凋亡

Caspase 家族是一大類凋亡調(diào)控因子，其中Caspase-3 與細胞凋亡關(guān)系密切。Caspase-3 是Caspase 家族群中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，其主要由凋亡刺激激活，參與腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷的細胞凋亡過程。有研究表明Caspase-3 主要通過線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路裂解細胞內(nèi)的相關(guān)酶，破壞細胞骨架和核骨架，改變細胞形態(tài)來介導(dǎo)細胞凋亡[24]。王亞康等[25]的大鼠腦缺血再灌注實驗發(fā)現(xiàn)，大腦缺血部位實現(xiàn)再灌注后Caspase-3 表達上調(diào)，凋亡細胞增加?？梢姡珻aspase-3 作為凋亡效應(yīng)因子，在腦缺血后遺損傷中起著關(guān)鍵的作用。

（二）NF-κB 與細胞凋亡

NF-κB 家族二聚體與IκB-α（NF-κB 的抑制蛋白）存在于細胞質(zhì)中，在靜息狀態(tài)下的三聚體形式不具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力，蛋白激酶刺激可使之激活，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄作用。目前研究激活途徑有兩條[26]：一是IκB-α 發(fā)生磷酸化，使NF-κB 游離于胞漿中，迅速發(fā)生核移位；二是不依賴IκB，而是酪蛋白激酶2（CK2）活化后引起IκB-α 的C 端磷酸化，通過p38 絲裂原活化蛋白激酶。還有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子的表達發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用。等人有研究顯示在CIRI 細胞中觀察到細胞內(nèi)鈣超載、氧自由基形成等現(xiàn)象，通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，活化 NF-κB，誘導(dǎo)凋亡基因（TRAIL-1 和TRAIL-2 死亡受體）表達上調(diào)，發(fā)揮促細胞凋亡作用[27]。

（三）Bcl-2/Bax 與細胞凋亡

Bcl-2 家族蛋白有兩個最主要的成員，Bcl-2 和Bax，它們的表達變化對細胞凋亡起重要的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，Bax 是一種促凋亡蛋白，二者相互作用構(gòu)成一個平衡體系，共同形成Bcl-2 家族中一組重要的細胞凋亡調(diào)節(jié)因子。在細胞受到各種刺激因素作用的狀態(tài)下，Bcl-2 和Bax的表達水平會發(fā)生變化，研究者發(fā)現(xiàn)Bcl-2和Bax之間的平衡狀態(tài)如果打破，可以通過測定二者表達的比值來確定細胞的凋亡狀態(tài)：當 Bcl-2 表達高于Bax 時抑制細胞凋亡，Bax表達高于Bcl-2 時則促進細胞凋亡，同時還發(fā)現(xiàn)抑制Bax 通道活性可以降低缺血再灌注后的細胞凋亡[28-29]。

三、NRG-1/ErbB4 信號通路與CIRI 細胞凋亡

NRG-1 和它的受體EbrB 信號通路在神經(jīng)元的生長、分化和存活和CIRI 細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。研究顯示，發(fā)生CIRI 時，頸內(nèi)靜脈注射NRG-1 可降低神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞環(huán)氧化酶2 和腦組織水通道蛋白4 的表達量，促進抗凋亡因子過氧化物歧化酶表達[30]。此外，Guo 等[31]還發(fā)現(xiàn)NRG-1 可以降低CIRI 時TNF-α 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 的表達。NRG-1 的神經(jīng)保護作用還與IL-1β mRNA 表達減少有關(guān)[30,32]。將NRG-1 側(cè)腦室注入腦缺血再灌注模型，可檢測到腦組織中抗凋亡分子Bcl-2 和Bcl-w 表達量增加，同時可降低MMP-9、次級線粒體源性Caspase 激活劑的表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡，使腦梗死范圍縮小[31,33]。

而根據(jù)RNA 剪切方式的不同，由nrg-1 基因編碼的 NRG-1 可以存在有30 余種蛋白形式，NRG 與其功能性受體 ErbB 受體結(jié)合后形成二聚體，使細胞內(nèi)酪氨酸殘基自身磷酸化，誘導(dǎo)ErbB 受體構(gòu)象改變，激活下游信號通路，參與各種生理病理過程。NRG-1 通過其受體ErbB4 在大腦神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、突觸功能及可塑性、GABAA 及乙酰膽堿受體亞基的表達等也起著至關(guān)重要的作用。盧應(yīng)梅等[34]通過檢測小鼠腦組織中EbrB4 蛋白表達的經(jīng)時變化，驗證缺血性腦損傷后ErbB4 蛋白在神經(jīng)元細胞的表達變化，NRG-1對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元細胞結(jié)合缺氧缺糖條件下誘發(fā)的神經(jīng)元細胞損傷有一定保護作用。腦缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)元損傷最早從紋狀體皮質(zhì)下區(qū)開始，這時神經(jīng)元損傷與興奮性氨基酸毒性有關(guān)；緊接著腦梗死逐漸擴展至鄰近區(qū)域和大腦皮質(zhì)，這時神經(jīng)元死亡涉及凋亡機制與炎癥反應(yīng)，NRG-1 腦室給藥可以有效減少腦梗塞灶的體積，并且腦缺血再灌注模型注射NRG-1 能使腦皮質(zhì)梗死范圍縮小，但紋狀體梗死區(qū)變化不大，這提示 NRG-1 減少炎癥因子和神經(jīng)元凋亡具有組織特異性和主要在缺血再灌注中后期發(fā)揮作用[35]。

四、針刺經(jīng)NRG-1/ErbB4 信號通路對CIRI 的作用

近年來，已有研究顯示內(nèi)源性NRG 1 在多種由缺血再灌注引起的神經(jīng)損傷中發(fā)揮作用，而針對NRG-1 及其下游信號通路與腦缺血損傷的臨床治療相關(guān)的研究日趨增多。以往，在CIRI 的治療中，外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受血腦屏障阻礙，而內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達低下，治療效果欠佳。張麗麗等[36]研究使用醒腦開竅針法電針刺激水溝和內(nèi)關(guān)，通過HE、TUNEL 和免疫組化技術(shù)，觀察了醒腦開竅針法對缺血再灌注大鼠腦組織中病理生理狀態(tài)、神經(jīng)元凋亡情況、NRG-1 及其受體ErbB4 蛋白表達情況的影響，發(fā)現(xiàn)醒腦開竅針法可提高內(nèi)源性NRG-1 及其受體ErbB4 的表達，對缺血再灌注腦損傷起著積極的神經(jīng)保護作用。

五、前景展望

信號通路與CIRI 發(fā)生發(fā)展機制的關(guān)系已受到大量的關(guān)注，而針刺療法作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中一種非藥物療法，已收入進《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中風(fēng)病的Ⅱ級推薦治療措施中。目前，國內(nèi)外針刺經(jīng)NRG-1/ErbB4 信號通路對CIRI 的研究在國內(nèi)外未見報道，若能通過電針干預(yù)治療CIRI 的機理從誘導(dǎo)內(nèi)源性的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白NRG 及其受體ErbB4 角度進行研究，將對臨床上治療CIRI 提供新的臨床思路，同時對提高臨床療效大有裨益，但是目前國內(nèi)外對于此通路的研究資料尚且不足，有待開展更進一步實驗研究，對針灸理論與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的聯(lián)系產(chǎn)生更全面、具體和深刻的認識。