方靜，向梅，向桂玲，姚遙

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266003；2荊州市醫(yī)療事故技術(shù)鑒定辦公室；3武漢大學(xué)人民醫(yī)院)

近年來(lái)，125I粒子連續(xù)低劑量照射因其創(chuàng)傷低、靶向效果佳、并發(fā)癥少等特點(diǎn)，越來(lái)越廣泛用于胃癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤治療[1]。環(huán)氧化酶-2(Cox-2)過(guò)表達(dá)于肺癌、胃癌、宮頸癌等惡性腫瘤，并與疾病預(yù)后密切相關(guān)，塞來(lái)昔布作為Cox-2特異性抑制劑，在腫瘤防治中備受關(guān)注。有研究表明，塞來(lái)昔布在肺癌、胃癌、宮頸癌等惡性腫瘤的治療中具有放射增敏作用[2]。本研究應(yīng)用125I粒子聯(lián)合塞來(lái)昔布治療人胃癌裸鼠移植瘤模型，觀察抑瘤效果和放射增敏作用，并初步探討相關(guān)的抑制機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料4～6周齡BALA/c-nu小鼠48只，雌性，體質(zhì)量16～18 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[合格證號(hào)SCXK(京)2014-0004]；人胃癌MKN45細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(美國(guó)ATCC公司)；125I粒子由北京智博高科生物技術(shù)有限公司提供；4%多聚甲醛購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取液購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；引物由上海生物工程有限公司合成；Ki-67兔抗鼠單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司；RM2016病理切片機(jī)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司；Nikon DS-U3成像系統(tǒng)購(gòu)自日本尼康；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；FBZ2001-up-p標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀購(gòu)自青島富勒姆科技有限公司。

1.2動(dòng)物分組及MKN45移植瘤模型構(gòu)建 取對(duì)數(shù)期MKN45細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，接種于裸鼠左背部近頭側(cè)皮下，7 d左右成瘤，待腫瘤長(zhǎng)至(300±50)mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、粒子植入組和聯(lián)合治療組，每組12只。125I粒子活度為0.6 mCi，固定裸鼠，消毒瘤體及周圍皮膚，用穿刺針將粒子置入瘤體中央。對(duì)照組和粒子植入組改飲含0.025%Tween-20和0.5%羧甲基纖維素鈉的水溶液，塞來(lái)昔布組和聯(lián)合治療組飲含塞來(lái)昔布的溶液[(溶解在 0.025%Tween-20 和0.5%羧甲基纖維素鈉的水溶液中，100 mg/(kg·d)]；粒子植入組和聯(lián)合治療組置入一枚125I粒子，連續(xù)觀察30 d，測(cè)量移植瘤的最長(zhǎng)徑和橫徑，斷頸法處死裸鼠，取一小塊粒子附近瘤組織放入4%多聚甲醛，固定24 h；余下的瘤組織于液氮保存，粒子全部取出，集中于鉛盒，做安全處理。

1.3裸鼠腫瘤體積、抑瘤率測(cè)算按公式V=L×W2/2(L:最長(zhǎng)徑，W:與L相垂直的橫徑)計(jì)算腫瘤體積；抑瘤率(IR)=(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%。

1.4各組瘤細(xì)胞增殖、凋亡情況觀察 按免疫組化SP法對(duì)Ki-67進(jìn)行免疫化學(xué)分析；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)所取瘤組織進(jìn)行凋亡檢測(cè)。結(jié)果判定：Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞主要位于細(xì)胞核，為棕黃色或棕褐色染色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400×)，分別計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及腫瘤細(xì)胞總數(shù)。增殖指數(shù)(PI)%=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%；TUENL判定方法與Ki-67相同，凋亡指數(shù)(AI) %=凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%[3]。

1.5腫瘤組織中Caspase-8、Bax mRNA表達(dá)測(cè)定采用RT-PCR法。反應(yīng)條件：95 ℃變性15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參為β-actin，mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。引物序列由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：Caspase-8正向引物：5′-TACTCGAGATGGCGGAGTCTTCGGATAA-3′，反向引物：5′-TAGGGCCCTTACCACAGGGAGGTCTTAA-3′，產(chǎn)物234 bp；Bax正向引物：5′-GCCCACCAGCTCTGAGCAGATCAT-3′，反向引物：5′-CGGCAATCATCCTCTGCAGC-3′，產(chǎn)物209 bp；β-actin正向引物：5′-TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3′，反向引物：5′-GAGCAATGATCTTGATCTTC-3′，產(chǎn)物260 bp。

2　結(jié)果

表1　　　　治療30 d時(shí)各組裸鼠瘤重、腫瘤體積

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與塞來(lái)昔布組比較，bP<0.05；與粒子植入組比較，cP<0.05。

2.2各組腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡情況比較對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、粒子植入組、聯(lián)合治療組PI分別為81.04%±10.12%、77.20%±6.22%、56.20%±8.35%、52.60%±6.03%；對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、粒子植入組、聯(lián)合治療組AI分別為62.50%±4.69%、68.80%±5.52%、82.04%±2.58%、86.83%±4.51%。組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3各組腫瘤組織中Caspase-8、Bax mRNA表達(dá)量比較對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、粒子植入組、聯(lián)合治療組Caspase-8 mRNA表達(dá)量依次增多，分別為1、1.38±0.12、1.72±0.35、2.36±0.33；對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、粒子植入組、聯(lián)合治療組Bax mRNA表達(dá)量同樣依次增多，分別為1、2.04±0.22、2.46±0.58%、3.13±0.51。組間兩兩比較，P均<0.05。

3　討論

胃癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率高，預(yù)后較差。傳統(tǒng)放療在胃癌治療中占重要地位，然而引起周圍正常組織壞死、輻射劑量大等不良反應(yīng)使其臨床應(yīng)用受限。近年來(lái)，近距離放射治療做為惡性腫瘤的輔助治療已越來(lái)越廣泛用于臨床，125I粒子是該治療常用的放射性粒子，在腫瘤組織局部持續(xù)低劑量釋放射線，最大程度殺傷病灶，而對(duì)周圍正常組織損傷較小[4]。研究證實(shí)塞來(lái)昔布在腫瘤治療中有很好的放射增敏作用，還能發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。本研究中，我們通過(guò)構(gòu)建人胃癌裸鼠移植瘤模型，探討125I放射性粒子聯(lián)合塞來(lái)昔布是否能達(dá)到放射增敏效應(yīng)，是否通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡達(dá)到目的，以及Caspase-8、Bax基因是否參與調(diào)控等。

前列腺素可誘導(dǎo)腫瘤形成、腫瘤微血管生成、遏制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而Cox-2抑制劑是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的主要限速酶。Cox-2表達(dá)在惡性腫瘤生成的早期上調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，與惡性腫瘤預(yù)后較差密切相關(guān)。Cox-2高表達(dá)還與腫瘤對(duì)放化療藥物的耐受性有關(guān)[6]。近年來(lái)，塞來(lái)昔布作為一線Cox-2抑制劑與癌癥的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。塞來(lái)昔布是一種非甾體抗炎藥(NSAIDs)，與其他NSAIDs一樣，能在體內(nèi)和體外干擾腫瘤的生成或腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。左朝暉等[7]通過(guò)構(gòu)建肝癌HepG2裸鼠移植瘤，證實(shí)塞來(lái)昔布通過(guò)抑制Cox-2表達(dá)，能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)和腫瘤微血管形成。相關(guān)的體內(nèi)研究表明，塞來(lái)昔布通過(guò)下調(diào)Survivin表達(dá)，抑制人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。這些發(fā)現(xiàn)均提示塞來(lái)昔布是很有潛力的抗癌藥物。梁彩霞等[9]觀察塞來(lái)昔布對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和宮頸癌HeLa細(xì)胞株的放射增敏作用，表明塞來(lái)昔布能有效抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射損傷的修復(fù)能力，增強(qiáng)放射線的殺傷力。李麗萍等[10]通過(guò)回顧分析90例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者，證實(shí)塞來(lái)昔布可增加NSCLC患者的放療敏感性，提高臨床療效、延長(zhǎng)患者生存期。

本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的胃癌MKN45細(xì)胞株接種到裸鼠皮下形成移植瘤，125I放射性粒子聯(lián)合塞來(lái)昔布進(jìn)行治療，結(jié)果顯示對(duì)照組腫瘤體積和瘤重較另外三組增大，聯(lián)合治療組腫瘤體積和瘤重則比塞來(lái)昔布組和粒子植入組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組腫瘤中央?yún)^(qū)出現(xiàn)潰破壞死，聯(lián)合治療組未見(jiàn)，可能與塞來(lái)昔布的抗腫瘤、抗炎作用相關(guān)。塞來(lái)昔布組、粒子植入組和聯(lián)合治療組抑瘤率分別為19.9%、45.3%、61.3%，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明125I放射性粒子聯(lián)合塞來(lái)昔布能明顯抑制胃癌移植瘤的生長(zhǎng)，呈放射增敏效應(yīng)。

凋亡是一系列形態(tài)學(xué)變化和生化反應(yīng)構(gòu)成的細(xì)胞程序性死亡，在免疫系統(tǒng)和自體調(diào)節(jié)系統(tǒng)等多種生物進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。非典型細(xì)胞通過(guò)凋亡的抑制而存活，顯著促進(jìn)惡性腫瘤生成，使癌細(xì)胞特異性生長(zhǎng)。凋亡同時(shí)亦是放化療細(xì)胞毒性效應(yīng)之一。Ma等[11]構(gòu)建NCI-N87胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤，采用125I粒子進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明125I粒子能誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)還抑制移植瘤的生長(zhǎng)。大量研究表明，Cox-2抑制劑亦可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的增殖指數(shù)下降、凋亡指數(shù)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。塞來(lái)昔布聯(lián)合125I放射性粒子通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡治療腫瘤，發(fā)揮放射增敏效應(yīng)。

Caspase-8可自我活化，參與細(xì)胞凋亡的起始，啟動(dòng)凋亡的細(xì)胞內(nèi)途徑。Bax是Bcl-2家族最有代表性的促凋亡基因之一，可在體內(nèi)拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用。激活的Caspase-8能在胞質(zhì)中裂解Bcl-2家族成員Bid，與Bax發(fā)揮促凋亡作用[13]。鐘漓等[14]研究表明，塞來(lái)昔布能抑制Bcl-2基因表達(dá)、促進(jìn)Bax基因表達(dá)，從而開(kāi)啟線粒體凋亡通路。Liu等[15]研究顯示，塞來(lái)昔布可下調(diào)鼻咽癌HONE-1細(xì)胞的Bcl-2基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增加鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性。本研究結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的腫瘤組織Caspase-8、Bax mRNA表達(dá)量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示125I放射性粒子聯(lián)合塞來(lái)昔布通過(guò)上調(diào)促凋亡相關(guān)基因Caspase-8、Bax表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高放療敏感性。

百年大計(jì)，質(zhì)量第一。水利電力工程關(guān)系著人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全。抓好工程建設(shè)質(zhì)量管理是每一個(gè)工程參建單位義不容辭的責(zé)任。工程建設(shè)項(xiàng)目法人在抓質(zhì)量上應(yīng)首先抓好工程項(xiàng)目承建單位的擇優(yōu)選取工作：一是對(duì)參標(biāo)單位進(jìn)行認(rèn)真的調(diào)研，參標(biāo)企業(yè)實(shí)力要與擬招工程項(xiàng)目相適應(yīng)；二是選擇中標(biāo)單位時(shí)以選擇擬定進(jìn)場(chǎng)的項(xiàng)目經(jīng)理為主要條件；三是商討合同協(xié)議書(shū)時(shí)，必須注明選定的項(xiàng)目經(jīng)理在承建工程施工完成前不得更換。

總之，塞來(lái)昔布通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡增強(qiáng)患者的125I粒子輻射敏感性，達(dá)成更強(qiáng)的抑瘤效果；其促凋亡機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡基因Caspase-8、Bax表達(dá)有關(guān)。

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