董超，羅春香，陳印，曾佳佳，吳仕賢,楊潤(rùn)祥

(1昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，昆明 650118；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3曲靖市第一人民醫(yī)院)

自20世紀(jì)90年代以來，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)，已躍居女性惡性腫瘤發(fā)病第1位,新發(fā)病例占全球的12.2%，病死率占9.6%,嚴(yán)重威脅中國(guó)女性的健康[1]。由于公眾意識(shí)和早期篩查的普及度不夠，確診乳腺癌的患者分期較晚且占多數(shù)。而早期乳腺癌患者在接受輔助治療后，仍有30%最終會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，這亦是乳腺癌死亡的主要原因。MTDH基因即轉(zhuǎn)移黏附基因(MTDH)，已被證實(shí)是多種惡性腫瘤的癌基因，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及化療耐藥等過程中發(fā)揮重要作用[2～4]。已有研究證實(shí)，MDTH基因過表達(dá)與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥密切有關(guān)，可作為乳腺癌病情進(jìn)展和不良預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)[5,6]。2016年5月，我們應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)(siRNA)下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中MTDH表達(dá)，探討對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購(gòu)自云南昆明動(dòng)物所，MTDH-siRNA和Control-siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，按說明書操作配成溶液備用。熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。MTDH-siRNA-1432抗體和β-actin蛋白購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、MTDH-siRNA的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染效率測(cè)算乳腺癌MCF-7細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DF-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)消化細(xì)胞并接種，按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染MTDH-homo-1432,對(duì)照組轉(zhuǎn)染等劑量的control-FAM。將0.5×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中,轉(zhuǎn)染組取10 μL/孔Lipofectamin2000(使用前輕輕搖勻)，用250/μL Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium稀釋。對(duì)照組取10 μL FAM-siRNA，用250 μL Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium 稀釋，輕輕混合均勻?？瞻捉M只加轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染24 h后即可檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。使用熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。只有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞才可看到FAM綠色熒光。

1.3MTDH基因表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法?？俁NA提取試劑和PCR試劑盒購(gòu)自昆明豐科生物科技有限公司。MTDH引物由大連寶生物公司合成，β-actin基因引物來自云南省腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)室序列，MTDH正向引物：5′-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3′，反向引物：5′-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3′，引物大小為334 bp；β-actin正向引物：5′-GTTGCTGTTCGAAAGCATCTTG-3′，反向引物:5′-AATATCGAGCCAAACGGTGAA-3′，引物大小為100 bp。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化并收集細(xì)胞，TRIzol酚氯仿法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，0D260/280值。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA按照說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃變性，50 ℃退火，60 ℃延伸，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，成像拍照。

1.4MTDH蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫印跡法(Western blotting)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染前后MCF-7細(xì)胞，將細(xì)胞懸液離心，棄上清，加新鮮培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)后稀釋到1×106細(xì)胞/mL，然后將其吹打混勻后取3 mL接種于六孔板內(nèi)。培養(yǎng)48 h后，PBS漂洗細(xì)胞2次，6孔板每孔加入100 μL RIPA冰上裂解細(xì)胞30 min，每孔收集所有裂解物至1.5 mL離心管中，4 ℃離心機(jī)，12 000 g×10 min,取上清即為細(xì)胞總蛋白。采用蛋白試劑盒(BCA)進(jìn)行蛋白定量,酶標(biāo)儀567 nm讀取吸光度值，計(jì)算得到樣品實(shí)際濃度，制備10% SDS-PAGE凝膠,每泳道加蛋白50 μg進(jìn)行電泳,全程穩(wěn)壓120 V電泳對(duì)目的蛋白樣品進(jìn)行分離。將分離出來的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉液室溫下封閉1 h。按1∶1 000比例稀釋一抗抗體MTDH-siRNA-1432，4 ℃孵育過夜。回收一抗抗體,TBST洗膜液洗膜,用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜液洗膜3次，每次5 min。加入ECL發(fā)光底物,均勻滴到膜上，反應(yīng)1 min，放入化學(xué)發(fā)光成像儀中檢測(cè)目的蛋白。

1.5細(xì)胞增殖情況檢測(cè)采用MTT法。轉(zhuǎn)染組(MTDH-siRNA-1432)、對(duì)照組(Negative control FAM /GAPDH Positive control)、空白組(Blank)，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染前后MCF-7細(xì)胞，以1×103/孔接種于96孔板中；然后在96孔板中加100 μL的培養(yǎng)液，鋪板均勻后放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。分別于轉(zhuǎn)染24、48、72、96、120、144 h后加MTT溶液(20 μL/孔)，37 ℃避光孵育4 h后，緩緩小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，待沉淀振蕩溶解后，將酶標(biāo)儀調(diào)定在490 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值并計(jì)算5個(gè)復(fù)孔的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染48 h后MCF-7細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板貼壁培養(yǎng)24 h，胰酶消化，用-20 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液沖洗細(xì)胞3次。取200 μL緩沖液將細(xì)胞重懸于流式管中，加入5 μL碘化丙啶(PI)溶液(50 μg/mL)和 10 μL FITC-Annexin V 溶液(10 μg/mL)，暗盒中孵育20 min后再加入300 μL，結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.7細(xì)胞周期檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞8×106個(gè)于1.5 mL離心管中,加入500 μL預(yù)冷70%乙醇重懸，冰上固定30 min后離心，分別加入TDT反應(yīng)液及陰性對(duì)照液30 μL,置37 ℃下，孵育，洗滌，離心。加入100 μg/mL的PI溶液1 mL，避光放置15～30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

2　結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染對(duì)MTDH表達(dá)的影響根據(jù)參考文獻(xiàn)合成MTDH-siRNA，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%。轉(zhuǎn)染48 h，MTDH-siRNA-1432對(duì)MTDH表達(dá)的干擾作用最為顯著，抑制效率達(dá)89%。瓊脂凝膠證實(shí)siRNA-1432對(duì)MTDH有顯著抑制作用(圖1)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組對(duì)MTDH蛋白表達(dá)有干擾作用 (圖2)。

圖1　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MTDH抑制效果

圖2　Western blotting檢測(cè)MTDH蛋白表達(dá)

2.2乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖情況比較與對(duì)照組、空白組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用增加(P均<0.05)。見表1。

2.3乳腺癌MCF-7細(xì)胞干擾前后細(xì)胞周期、凋亡和壞死比例比較 轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞較空白組及對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；轉(zhuǎn)染組G2+S期細(xì)胞較空白組及對(duì)照組減少(P均<0.01)。轉(zhuǎn)染組凋亡和壞死比例較空白組和對(duì)照組增加(P均<0.01),見表2。

3　討論

MTDH是近年來研究較多的一個(gè)癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。其參與和激活PI3K/AKT途徑、NF-κB途徑、MAPK途徑等多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，加速腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的進(jìn)程[7]。大量研究提示，MDTH可作為腫瘤診斷潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，通過下調(diào)MDTH的表達(dá)可阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高化療療效[8]。MTDH在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥中發(fā)揮重要作用[9]。

表1　各組不同時(shí)點(diǎn)MCF-7細(xì)胞增殖情況比較(OD值,

表2　　　　各組MCF-7細(xì)胞周期、凋亡和壞死細(xì)胞

RNA干擾(RNAi)是指利用具有同源性的雙鏈RNA誘導(dǎo)目標(biāo)基因的沉默，能迅速阻斷基因活性。siRNA是RNAi發(fā)揮關(guān)鍵作用的必需因子，對(duì)靶序列的識(shí)別有高度特異性。通過基因干擾技術(shù)降低目標(biāo)基因的表達(dá)，既可阻斷腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的相關(guān)信號(hào)通路，亦可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)臨床放化療的敏感性。本研究通過RNAi技術(shù)下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞MDTH的表達(dá)，并應(yīng)用RT-PCR和Western blotting技術(shù)對(duì)基因沉默的效果進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，MTDH-siRNA-1432對(duì)MTDH表達(dá)的干擾作用最為顯著，抑制效率達(dá)89%。此與國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453和MDA-MB-231的研究結(jié)果一致[10]。MTDH高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力，并上調(diào)HER2/neu表達(dá)，推測(cè)其可能是通過上調(diào)HER2/neu表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[11]。研究表明,MDTH可能是肺癌的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，下調(diào)MDTH表達(dá)可能促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，MTDH基因下調(diào)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。siRNA下調(diào)MTDH基因表達(dá)后，與對(duì)照組和空白組相比，MCF-7乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞明顯增加,G2+S期細(xì)胞明顯減少。表明MTDH-siRNA可將細(xì)胞阻滯于DNA合成前期(G1)，而在DNA合成期(S)和合成后期(G2)細(xì)胞比例下降，進(jìn)一步證實(shí)增殖周期的細(xì)胞減少。提示MTDH基因可能參與乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控過程，下調(diào)MTDH表達(dá)可阻止細(xì)胞進(jìn)入增殖周期,讓細(xì)胞停滯于G1期。流式細(xì)胞結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡和壞死比例亦較空白組和對(duì)照組增加,提示siRNA下調(diào)MTDH基因表達(dá)可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡和壞死。

綜上所述，下調(diào)MTDH表達(dá)，可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡和壞死。

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