陳勝東，王達飛，許益芬，姚亞云，龔偉達

(1 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2 宜興市腫瘤醫(yī)院)

胃癌5年總生存率低于30%，是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的第二大腫瘤，亞洲東部是胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)[1]。目前臨床以手術(shù)切除為基礎(chǔ)，輔以放化療的綜合治療是胃癌患者的主要治療方案，奧沙利鉑(L-OHP)及其他鉑類抗癌藥是治療胃癌的一線化療用藥，然而在化療過程中對L-OHP產(chǎn)生獲得性耐藥是導(dǎo)致胃癌患者治療失敗，不良預(yù)后甚至死亡的重要原因[2]。近年來，臨床采用多藥聯(lián)合的化療方案，以減少化療耐藥的產(chǎn)生、提高臨床療效，但其療效并不理想[3]。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞化療耐藥性的產(chǎn)生多伴隨上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，促進EMT表型的信號通路亦參與了腫瘤化療耐藥性的產(chǎn)生，如TGF-β/Smad4、Wnt/β-catenin信號通路等[4]。據(jù)報道，轉(zhuǎn)錄因子E盒結(jié)合鋅指蛋白2(ZEB2)能抑制細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達，促進EMT過程[5]。采用siRNA技術(shù)沉默ZEB2基因表達，能逆轉(zhuǎn)EMT過程[6]。盡管ZEB2的功能已被闡明，然而在腫瘤細(xì)胞中沉默ZEB2基因表達的研究較少，尤其是胃癌細(xì)胞。2015年1月～2016年6月，我們采用siRNA方法沉默ZEB2基因表達，探討其對胃癌細(xì)胞L-OHP耐藥性的影響。

1　材料與方法

1.1材料 胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)、脂質(zhì)體Lipofectamine 3000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen生命技術(shù)有限公司，L-OHP購自齊魯制藥(海南)有限公司，MTT溶液試劑盒購自上海哈靈生物有限公司，siRNA干擾片段購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，qRT-PCR引物序列購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，RIPA裂解液、BCA試劑盒和ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，羊抗人ZEB2多克隆抗體(ab138222)購自美國Abcam公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(sc-420486)購自美國Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的鼠抗羊和兔抗鼠二抗分別購自南京金斯瑞生物科技有限公司和上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司。培養(yǎng)箱(MCO-18AC，日本SANYO公司)，全波長酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司，美國)，紫外分光光度計(ND-2000，美國Thermo Fisher Scientific科技公司)，熒光定量PCR儀(ABI PRISM?7300，美國ABI公司)，凝膠成像儀(Tanon 4200 SF，上海天能科技有限公司)，流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ，美國BD公司)。

1.2耐藥乳腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建采用間歇刺激法誘導(dǎo)建立胃癌SGC-7901細(xì)胞的耐藥細(xì)胞株，細(xì)胞均生長于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，10×104U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。高濃度L-OHP (注) 20 μg/mL作用于對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，4 h后撤藥，恢復(fù)正常RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每周刺激1次，6個月內(nèi)共刺激12次，建立的耐藥細(xì)胞株命名為SGC-7901/L-OHP。

1.3L-OHP對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值測算采用MTT法。取處于對數(shù)生長期的SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細(xì)胞，分別接種于96孔板中，每孔接種8×103個細(xì)胞，24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔分別加入100 μL含有不同濃度L-OHP(0、2.5、5.0、10.0、100、200、400 μg/mL)的RPMI1640培養(yǎng)液，設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄上清，每孔加入100 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL)，37 ℃恒溫孵育4 h，棄上清MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO溶劑，充分溶解后，全波長酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度值，計算細(xì)胞存活率。SPASS軟件計算IC50值，耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞的IC50/親本細(xì)胞的IC50。

1.4沉默ZEB2基因表達后SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對L-OHP藥物敏感性檢測采用MTT法。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中12 h后，不同濃度L-OHP(0、2.5、5.0、10.0、100、200、400 μg/mL)分別處理空白對照組、NC組和si-ZEB2組的SGC-7901/L-OHP細(xì)胞48 h，MTT法檢測L-OHP對各組SGC-7901/L-OHP細(xì)胞的IC50值。

1.5siRNA-ZEB2對ZEB2基因的沉默效率測算采用熒光實時定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting法。取4×105個處于對數(shù)生長期的SGC-7901/L-OHP細(xì)胞，接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，24 h后分為空白對照組、si-ZEB2組和NC組，si-ZEB2組和NC組采用脂質(zhì)體Lipofectamine3000分別將siRNA-ZEB2(正向引物：5′-GGCAAGGCCUUCAAAUAUATT-3′，反向引物：5′-UAUAUUUGAAGGCCUUGCCTT-3′)、siRNA無關(guān)序列(陰性對照組即NC組)轉(zhuǎn)染至SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中，空白對照組不轉(zhuǎn)染siRNA的SGC-7901/L-OHP細(xì)胞，操作步驟參照試劑說明書。

1.6ZEB2 mRNA表達檢測采用qRT-PCR法。TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA，參照RNA提取試劑盒說明書操作。紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。ZEB2：正向引物：5′-AGGAGCAGGTAATCG-3′，反向引物：5′-TGGGCACTCGTAAGG-3′。熒光定量PCR儀檢測ZEB2 mRNA表達。qRT-PCR擴增體系為10 μL，反應(yīng)條件：50 ℃，2 min，95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算ZEB2的mRNA相對表達量。

1.7ZEB2 蛋白表達檢測采用Western blotting法。收集細(xì)胞，RIPA裂解液抽提細(xì)胞全蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。8% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，分別加入羊抗人ZEB2多克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，分別加入HRP標(biāo)記的鼠抗羊和兔抗鼠二抗,室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液進行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀觀察蛋白條帶。

1.8細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP細(xì)胞12 h后，20 μg/mL L-OHP分別處理空白對照組、NC組和si-ZEB2組的SGC-7901/L-OHP細(xì)胞48 h，采用FCM，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組SGC-7901/L-OHP細(xì)胞凋亡百分比，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻，室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡百分比。

2　 結(jié)果

2.1SGC-7901/L-OHP細(xì)胞株的建立 MTT實驗結(jié)果顯示，SGC-7901、SGC-7901/L-OHP的IC50值分別為(13.02±3.14)、(100.75±14.16)μg/mL，SGC-7901/L-OHP細(xì)胞的RI為7.69，SGC-7901/L-OHP為L-OHP的穩(wěn)定耐藥細(xì)胞株。

2.2SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中ZEB2表達比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中ZEB2 mRNA相對表達量分別為1.12±0.21、5.62±1.28,ZEB2蛋白相對表達量分別為1.06±0.13、3.38±1.33，耐藥細(xì)胞SGC-7901/L-OHP中ZEB2的mRNA和蛋白表達均高于親本SGC-7901細(xì)胞(P均<0.05)。

2.3沉默ZEB2基因表達后SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對L-OHP藥物敏感性的影響MTT實驗結(jié)果顯示，si-ZEB2組SGC-7901/L-OHP細(xì)胞的IC50值為(27.06±7.43)μg/mL，低于空白對照組的(100.7±14.43)μg/mL和NC組的(91.95±16.43)μg/mL(P均<0.05)，而空白對照組和NC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

實施sbar交班模式后,晨交班時間為(18.25±2.68)min,相比于實施前晨交班時間(26.47±2.97)min,平均縮短8min,實施前后晨交班時間對比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義,t=10.8729,P<0.05。

圖1　　　　沉默ZEB2基因表達后SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對L-OHP藥物敏感性

2.4siRNA-ZEB2對ZEB2基因的沉默效率脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中12 h后，qRT-PCR結(jié)果顯示，ZEB2的mRNA表達降低至空白對照組和NC組的0.41倍(P<0.05)，而空白對照組和NC組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；Western blotting實驗結(jié)果顯示，ZEB2蛋白表達降低至空白對照組和NC組的0.37倍(P均<0.05)，而空白對照組和NC組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明siRNA-ZEB2干預(yù)后SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中ZEB2基因表達沉默。

2.5各組細(xì)胞凋亡率比較FCM實驗結(jié)果顯示，si-ZEB2組、空白對照組、NC組SGC-7901/L-OHP細(xì)胞凋亡率分別為55.32%±9.63%、20.63%±3.28%、22.83%±4.81%，si-ZEB2組與空白對照組、NC組比較，P均<0.05；而空白對照組和NC組比較，P>0.05。

3　 討論

早期胃癌患者的治療以手術(shù)切除為主、化療為輔，然而多數(shù)患者就診時已處于晚期，只能化療為主，以提高患者生活質(zhì)量、延長生存時間。鉑類抗癌藥是胃癌化療的一線用藥，L-OHP是繼順鉑和卡鉑之后的第三代鉑類抗癌藥，具有抗癌譜廣、溶解性及穩(wěn)定性好等特點，因其療效確切，已逐漸成為治療晚期胃癌的主要藥物，但在化療過程中獲得性耐藥的產(chǎn)生，是導(dǎo)致化療失敗的原因之一。

本研究以SGC-7901為親本細(xì)胞，采用體外間歇刺激法，成功建立人胃癌L-OHP耐藥細(xì)胞株SGC-7901/L-OHP，并采用MTT法檢測親本細(xì)胞SGC-7901及耐藥細(xì)胞SGC-7901/L-OHP對L-OHP的敏感性和IC50值，結(jié)果顯示，SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對L-OHP的RI為7.69，建立的SGC-7901/L-OHP細(xì)胞株對L-OHP屬于中度耐藥[7]，可用于進一步實驗研究。

EMT是誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的早期關(guān)鍵事件，近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生與耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。Shen等[8]報道，在子宮頸癌細(xì)胞中過量表達microRNA-375促進EMT發(fā)生的同時，不僅降低了細(xì)胞的增殖能力，且降低了癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性；在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中，沉默MCL-1基因表達，能逆轉(zhuǎn)EMT介導(dǎo)的化療耐藥[9]。最新證據(jù)表明，在卵巢癌[10]的耐藥細(xì)胞中，存在ZEB2過量表達。本研究結(jié)果顯示，SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中ZEB2的mRNA和蛋白表達高于SGC-7901細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示ZEB2參與了SGC-7901獲得性耐藥的產(chǎn)生過程。

Fang等[11]在非小細(xì)胞肺癌的多藥耐藥細(xì)胞H69AR中敲除ZEB2表達后，部分逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞的多藥耐藥表型。ZEB2作為抑制E-cadherin表達的轉(zhuǎn)錄因子，是EMT過程的主要激活因素，在腫瘤細(xì)胞化療耐藥中占重要地位。然而，胃癌中并沒有以沉默ZEB2基因表達為基礎(chǔ)的治療方案。SiRNA是一類在腫瘤治療中有巨大應(yīng)用前景的治療方案，可通過siRNA沉默腫瘤相關(guān)蛋白的表達，進而抑制腫瘤的惡性進展[12]。

本研究中，MTT試驗結(jié)果顯示，L-OHP對si-ZEB2組SGC-7901/L-OHP細(xì)胞的IC50值低于空白對照組和NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；相同濃度L-OHP處理空白對照組、NC組和si-ZEB2組SGC-7901/L-OHP細(xì)胞后。FCM試驗結(jié)果顯示，si-ZEB2組SGC-7901/L-OHP細(xì)胞凋亡百分比高于空白對照組和NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以上試驗結(jié)果初步證實，沉默ZEB2基因表達，能增強SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對L-OHP的化療敏感性，增加細(xì)胞凋亡比例，與Jin等[13]研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究成功建立對L-OHP耐藥的胃癌細(xì)胞株SGC-7901/L-OHP，且發(fā)現(xiàn)ZEB2在SGC-7901/L-OHP耐藥細(xì)胞中的表達增加，采用siRNA干擾技術(shù)沉默SGC-7901/L-OHP耐藥細(xì)胞中ZEB2基因表達后，減弱了細(xì)胞對L-OHP的耐藥性。

參考文獻：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Ilson DH. Current Progress in the Adjuvant Treatment of Gastric Cancer[J]. Surg Oncol Clin N Am, 2017,26(2):225-239.

[3] Hamada C, Yamada Y, Azuma M, et al. Meta-analysis supporting noninferiority of oxaliplatin plus S-1 to cisplatin plus S-1 in first-line treatment of advanced gastric cancer (G-SOX study): indirect comparison with S-1 alone[J]. Int J Clin Oncol, 2016,21(4):668-675.

[4] Li J, Liu H, Yu J, et al. Chemoresistance to doxorubicin induces epithelial-mesenchymal transition via upregulation of transforming growth factor β signaling in HCT116 colon cancer cells[J]. Mol Med Rep, 2015,12(1):192-198.

[5] He Y, Northey JJ, Pelletier A, et al. The Cdc42/Rac1 regulator CdGAP is a novel E-cadherin transcriptional co-repressor with Zeb2 in breast cancer[J]. Oncogene, 2017,36(24):3490-3503.

[6] Takeyama Y, Sato M, Horio M, et al. Knockdown of ZEB1, a master epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) gene, suppresses anchorage-independent cell growth of lung cancer cells[J]. Cancer Lett, 2010,296(2):216-224.

[7] Snow K, Judd W. Characterisation of adriamycin- and amsacrine-resistant human leukaemic T cell lines[J]. Br J Cancer, 1991,63(1):17-28.

[8] Shen Y, Zhou J, Li Y, et al. miR-375 mediated acquired chemo-resistance in cervical cancer by facilitating EMT[J]. PLoS One, 2014,9(10):e109299.

[9] Toge M, Yokoyama S, Kato S, et al. Critical contribution of MCL-1 in EMT-associated chemo-resistance in A549 non-small cell lung cancer[J]. Int J Oncol, 2015,46(4):1844-1848.

[10] Haslehurst AM, Koti M, Dharsee M, et al. EMT transcription factors snail and slug directly contribute to cisplatin resistance in ovarian cancer[J]. BMC Cancer, 2012,12:91.

[11] Fang S, Zeng X, Zhu W, et al. Zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) regulated by miR-200b contributes to multi-drug resistance of small cell lung cancer[J]. Exp Mol Pathol, 2014,96(3):438-444.

[12] Wang T, Shigdar S, Shamaileh HA, et al. Challenges and opportunities for siRNA-based cancer treatment[J]. Cancer Lett, 2017,387:77-83.

[13] Jin Z, Guan L, Song Y, et al. MicroRNA-138 regulates chemoresistance in human non-small cell lung cancer via epithelial mesenchymal transition[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2016,20(6):1080-1086.