張麗敏，凌江紅，2，周洲，徐寬，張鈺琴，謝天一，王煜姣

(1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2上海健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院)

Cajal間質細胞(ICCs)是胃腸活動的起搏者和調節(jié)者，對胃腸運動的調節(jié)起重要作用[1]。在人類[2]或動物[3]中，ICCs的數(shù)量減少或缺失、細胞網絡結構異常等應激損傷是導致該細胞活性減弱或消失，進而引發(fā)胃腸動力障礙的主要原因。因此，減輕ICCs的應激損傷，維持其細胞存活是一種有效促進胃腸動力的方法。內質網(ER)是調控細胞功能和維持細胞存活的重要細胞器之一，眾多因素可引起內質網穩(wěn)態(tài)的改變，使內質網功能缺陷或喪失，引發(fā)內質網應激(ERS)。RES可導致細胞損傷，為避免損傷，細胞將通過激活自噬的一個新分支，選擇性地降解受損內質網以維持細胞內穩(wěn)態(tài)。此自噬新分支由Bernales等[4]首先提出，稱其為內質網自噬。自噬具有雙向調節(jié)作用[5]，因此，抑制或激活內質網自噬成為潛在防治疾病的新靶點。但內質網自噬在ICCs的ERS損傷中的作用尚未明確。本研究旨在探討ERS引起ICCs損傷過程中內質網自噬的發(fā)生及其作用，為改善胃腸動力障礙提供新的靶標。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物：SPF級SD大鼠，鼠齡8周，體質量(150±10)g，雌雄不限，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK 桂 2015-0003。適應性喂養(yǎng)于室溫25 ℃、光照周期12 h/12 h的環(huán)境中1周，自由進食、進水。實驗前禁食不禁水8 h。主要試劑和儀器：胎牛血清(Gibco, USA)，M199培養(yǎng)基(Hyclone, USA)，Ⅱ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA、大鼠干細胞因子SCF、三甲基腺嘌呤3-MA、雷帕霉素(Rapa,Sigma)，CD117/c-kit山羊抗大鼠多克隆抗體(Pierce)，異硫氰酸熒光素(FITC)-山羊抗兔多克隆抗體(Life)，逆轉錄試劑盒(Thermo Fisher)，qPCR試劑盒(Qiagen)，CCK-8試劑盒(Dojindo)，衣霉素(TM)、Ficoll400、4%多聚甲醛溶液、抗熒光淬滅封片液(Solarbio)，青霉素-鏈霉素溶液、兩性霉素B、PBS溶液(Genom, China)，水合氯醛、戊二醛(Kelong)。醫(yī)用超凈工作臺(Airtech)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，高速冷凍離心機(Eppendorf)，解剖顯微鏡(Luxikj)，倒置相差顯微鏡、正置熒光顯微鏡(Olympus)，實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，酶標儀(Multiskan Ascent)。

1.2ICCs的分離和培養(yǎng)參考文獻[6, 7],采用酶解法分離大鼠胃竇ICCs。取SD大鼠3只/次，雌雄不限，禁食不禁水8 h。10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，25%戊二醛術前消毒。開腹取胃，沿胃小彎剪開，取長約3 cm胃竇，用4 ℃預冷的PBS溶液(含1%青霉素-鏈霉素溶液)清洗3次。在解剖顯微鏡下用銳性鑷子剝離黏膜層及黏膜下層，取胃肌條剪碎成1 mm×1 mm大小，加入Ⅱ型膠原酶消化液(M199培養(yǎng)基配置，終濃度1.3 mg/mL)。置于37 ℃恒溫水浴箱消化組織碎塊45～50 min，1 300 r/min離心1.5 min,棄上清，PBS溶液重懸，再次離心棄上清后加入M199培養(yǎng)基。緩慢吹打15 min重懸，過200目篩網，收集于離心管內，加入等量Ficoll400密度梯度液，1 900 r/min離心15 min，取交界面細胞。加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、M199培養(yǎng)基、1%青霉素-鏈霉素溶液、0.5%兩性霉素B和25 ng/mL干細胞因子)重懸細胞，調整細胞密度至1×106/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中(約4 mL/瓶)，于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后首次換液，此后細胞換液2～3 d/次，并使用倒置顯微鏡觀察細胞特征及生長狀態(tài)。取對數(shù)生長期的ICCs進行實驗。

1.3ICCs鑒定采用c-kit特異性抗體免疫熒光染色法。取對數(shù)生長期的ICCs，經0.25%胰蛋白酶消化，1 300 r/min離心1.5 min并棄上清，加完全培養(yǎng)基調整細胞密度，將細胞接種于含無菌圓形細胞爬片的24孔板中(1×104/孔)。貼壁24 h后棄去舊培養(yǎng)基，PBS溶液清洗3次，5 min/次。預冷的4%多聚甲醛固定10 min，PBS溶液清洗3次，5 min/次。5%脫脂奶粉封閉10 min，PBS溶液清洗3次，5 min/次。加入兔抗大鼠c-kit抗體(1∶100)，設立陰性對照組以PBS溶液代替c-kit抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。次日使用PBS溶液清洗3次，5 min/次，加入山羊抗兔FITC二抗(1∶200)后于37 ℃孵育1 h, PBS溶液清洗3次。將細胞爬片取出，滴加抗淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4實驗分組與處理采用TM誘導ICCs構建內質網應激模型。參考文獻[8]予2 μg/mL的TM作用6 h時可介導內質網自噬，結合預實驗予4 μmol/mL 3-MA和2 μmol/mL Rapa分別作用ICCs 6 h時細胞的存活率為最高，故以上述濃度進行實驗。將細胞隨機分為4組,ICCs組給予正常培養(yǎng)；ERS組給予2 μg/mL TM處理[8]；3-MA組給予2 μg/mL TM和4 μmol/mL 3-MA聯(lián)合作用；Rapa組給予2 μg/mL TM和2 μmol/mL Rapa聯(lián)合作用。各組時間均為6 h。

1.5GRP78、LC3B的mRNA表達檢測采用實時熒光定量qPCR法。各組ICCs根據分組要求加入相應的TM、3-MA或Rapa進行干預，采用TRIzol法提取總RNA，用紫外分光光度計測定樣品RNA純度。按照反轉錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉錄為cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＿M一步以SYBR Premix(10 μL)+cDNA模板(2 μL)+正/反向引物(各1 μL)+無核酸酶超純水(6 μL)的反應體系，上熒光定量PCR儀進行擴增反應。GAPDH為內對照。引物序列：GAPDH正向引物:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，反向引物:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。GRP78正向引物:5′-ACCTATTCCTGCGTCGGTGT，反向引物:5′-TTCCAAGTGCGTCCGATGAG-3′。LC3B正向引物:5′-CGGAGCTTCGAACAAAGAGTG-3′，反向引物:5′-TGCCTTGGTAGGGGCTTAAC-3′。每個樣品設立3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算各組mRNA的相對表達量。

1.6各組ICCs活性檢測采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的ICCs，經消化、離心、收集后，使用完全培養(yǎng)基重懸計數(shù)，以1×104/孔的細胞量接種于96孔板中，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2條件下)，24 h貼壁后常規(guī)更換培養(yǎng)基。按照分組要求加入相應的TM、3-MA或Rapa進行干預，每組重復6個孔，置于培養(yǎng)箱中6 h，每孔分別加入10 μL CCK-8(避免在孔中生成氣泡)，再于培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標儀測定在450 nm波長處各孔的光密度值(OD值)。實驗重復3次，取平均值。設不含ICCs的培養(yǎng)基為空白孔(Ab)，正常培養(yǎng)的ICCs組為對照孔(Ac)，ERS組、3-MA組和Rapa組為實驗孔(As)，細胞存活率為[(As- Ab)/( Ac- Ab)]×100%。

2　 結果

2.1ICCs鏡下細胞形態(tài)及免疫熒光染色鑒定對數(shù)生長期的ICCs細胞形態(tài)清晰，呈梭形、菱形或三角形，細胞核大、核周胞質少，胞體發(fā)出2～5條長突起，與相鄰ICCs的突起、胞體緊密連接成網絡狀，如圖1A。c-kit蛋白為ICCs的特異性蛋白，c-kit免疫標志的熒光染色法可對ICCs細胞進行特異性鑒定，如圖1B所示，陽性表達呈綠色。

圖1　ICCs的形態(tài)及熒光鑒定(×200)

2.2各組GRP78、LC3B mRNA表達比較與ICCs組比較，ERS組、3-MA組和Rapa組的GRP78、LC3B的mRNA表達均升高(P均<0.05)。與ERS組比較，3-MA組的GRP78 mRNA表達升高(P<0.05)，LC3B mRNA表達降低(P<0.05)；Rapa組的GRP78 mRNA表達降低(P<0.05)，LC3B mRNA表達升高(P<0.05)。見表1。

表1　各組GRP78、LC3B的mRNA表達比較

注：與ICCs組比較，*P< 0.05；與ERS組比較，#P<0.05。

2.3各組ICCs活性比較與ICCs組比較，ERS組、3-MA組和Rapa組細胞活性的OD值均降低(P均<0.05)；與ERS組相比，3-MA組細胞活性的OD值降低(P<0.05)，Rapa組細胞活性的OD值升高(P<0.05)。見表2。

表2　各組ICCs活性情況比較

注：與ICCs組比較，*P<0.05；與ERS組比較，#P<0.05。

3　討論

胃腸道的慢波節(jié)律紊亂和神經遞質信號傳導異常是胃腸動力障礙性疾病發(fā)生的共同原因，Cajal間質細胞是胃腸動力的基本單位，各種應激導致該細胞生理功能異常是多種胃腸疾病的關鍵機制[9]。已有臨床研究證實諸多胃動力障礙性疾病，如賁門失弛緩癥[10]、胃輕癱[11]、慢性特發(fā)性腸梗阻[12]及慢性傳輸型便秘[13]等與ICCs的功能異常有關。因此，修復ICCs的應激損傷，恢復細胞內穩(wěn)態(tài)是促進胃腸動力的基礎。原代培養(yǎng)的大鼠胃竇ICCs較好保存了原組織細胞的遺傳特征和生物學特性，為研究胃腸動力障礙性疾病的發(fā)病機制提供了細胞模型。本實驗根據鏡下細胞形態(tài)學特征和免疫熒光染色鑒定[7]，結果提示所培養(yǎng)的原代細胞為ICCs。

既往認為，自噬是非特異性降解細胞內成分及細胞器的代謝過程，但最新研究發(fā)現(xiàn)，部分自噬具有選擇性，如內質網應激可介導自噬[14]。內質網是蛋白質合成、折疊和分泌的重要場所，起到調節(jié)細胞內穩(wěn)態(tài)的重要作用。然而，細胞在受到氧化應激、細胞能量水平下降、鈣代謝紊亂等生理和病理因素的刺激下，內質網會出現(xiàn)未折疊或錯誤折疊蛋白的大量積累，引起內質網損傷，最終導致ERS反應。此時，內質網分子伴侶GRP78解離，參與調控未折疊蛋白反應，因此GRP78被作為ERS發(fā)生的標志性分子[15]。當未折疊或錯誤折疊蛋白過多，形成聚泛素化、穩(wěn)定難溶而且對蛋白酶體功能有一定毒性的蛋白聚集物時，將激活自噬清除細胞內受損的內質網，消除未折疊蛋白反應和降解有毒蛋白質聚集物，維持細胞的存活[16]。自噬發(fā)生時，LC3B結合并始終位于自噬體膜上，被作為檢測自噬表達水平的特異性方法[17]。本實驗以經典的ERS誘導劑TM作用于ICCs構建ERS模型，與ICCs組比較，ERS組GRP78的mRNA表達升高，提示ERS模型成立。同時，LC3B表達亦升高，說明在ICCs的ERS過程中伴隨內質網自噬的發(fā)生。

巨自噬是最常見的自噬形式，是非選擇性的形成雙層膜包裹的自噬體，再與溶酶體融合為自噬溶酶體的過程，巨自噬具有雙向調節(jié)作用[5]。Bernales等[4]在酵母中發(fā)現(xiàn)ERS的未折疊蛋白反應可引起內質網膨脹并重構，重構的內質網被雙層膜包裹擴展成囊泡，采用特異性內質網蛋白免疫標記證實囊泡膜來自內質網，因此提出這種選擇性自噬為內質網自噬。同樣，內質網自噬存在雙向調節(jié)作用[18]。ERS時，內質網自噬降解受損內質網積累的未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，從而預防疾?。坏诓±砬闆r下，過度激活的自噬亦可清除正常的內質網結構，反而使機體病變加劇。本研究結果表明，與ERS組比較，用自噬抑制劑3-MA干預后GRP78的表達升高，用自噬誘導劑Rapa干預后GRP78表達降低，且CCK-8法檢測結果進一步證實了3-MA使 ICCs的活性下降，而Rapa使ICCs的活性升高，結果提示內質網自噬可減輕ICCs的ERS損傷。

綜上所述，ICCs的ERS過程伴發(fā)內質網自噬，內質網自噬可減輕ICCs的ERS損傷。在胃腸動力障礙疾病中，如能通過促進內質網自噬以維持ICCs的存活，將為改善胃動力障礙提供新的靶點。但ERS介導ICCs內質網自噬的具體分子機制尚未明確，仍需進一步研究。

參考文獻：

[1] Sanders KM. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract[J]. Gastroenterology, 1996,111(2):492-515.

[2] Geraldino R, Ferreira A, Lima M, et al. Interstitial cells of Cajal in patients with chagasic megacolon originating from a region of old endemicity[J]. Pathophysiology, 2006,13(2):71-74.

[3] Ueshima S, Nishida T, Koike M, et al. Nitric oxide-mediated injury of interstitial cells of Cajal and intestinal dysmotility under endotoxemia of mice[J]. Biomedical Research, 2014,35(4):251-262.

[4] Bernales S, Schuck S, Walter P. ER-phagy: selective autophagy of the endoplasmic reticulum[J]. Autophagy, 2007,3(3):285-287.

[5] Mehrpour M, Esclatine A, Beau I, et al. Autophagy in health and disease. 1. Regulation and significance of autophagy: an overview[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2010,298(4):C776-C785.

[6] 張智,凌江紅,寧海恩,等.柴胡疏肝散含藥血清對大鼠胃Cajal 間質細胞增殖及細胞周期的影響[J].世界華人消化雜志,2015,23(30):4792-4799.

[7] 寧海恩,凌江紅,張智,等.酶解法分離與同源血清培養(yǎng)SD大鼠胃Cajal間質細胞的實驗研究[J].廣西中醫(yī)藥大學學報,2016,19(1):8-12.

[8] Ogata M, Hino S, Saito A, et al. Autophagy is activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress[J]. Mol Cell Biol, 2006,26(24):9220-9231.

[9] Yin J, Chen JD. Roles of interstitial cells of Cajal in regulating gastrointestinal motility: in vitro versus in vivo studies[J]. J Cell Mol Med, 2008,12(4):1118-1129.

[10] Villanacci V, Annese V, Cuttitta A, et al. An immunohistochemical study of the myenteric plexus in idiopathic achalasia[J]. J Clin Gastroenterol, 2010,44(6):407-410.

[11] Forster J, Damjanov I, Lin Z, et al. Absence of the interstitial cells of Cajal in patients with gastroparesis and correlation with clinical findings[J]. J Gastrointest Surg, 2005,9(1):102-108.

[12] Streutker C, Huizinga J, Campbell F, et al. Loss of CD117 (c-kit)-and CD34-positive ICC and associated CD34-positive fibroblasts defines a subpopulation of chronic intestinal pseudo-obstruction[J]. Am J Surg Pathol, 2003,27(2):228-235.

[13] Lee JI, Park H, Kamm MA, et al. Decreased density of interstitial cells of Cajal and neuronal cells in patients with slow‐transit constipation and acquired megacolon[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2005,20(8):1292-1298.

[14] Kouroku Y, Fujita E, Tanida I, et al. ER stress (PERK/eIF2 [alpha] phosphorylation) mediates the polyglutamine-induced LC3 conversion, an essential step for autophagy formation[J]. Cell Death Differ, 2007,14(2):230.

[15] Chen HY, Tsai WC, Chiu YL, et al. Triglyceride to high-density lipoprotein cholesterol ratio predicts cardiovascular outcomes in prevalent dialysis patients[J]. Medicine, 2015,94(10):e619.

[16] Volmer R, van der Ploeg K, Ron D. Membrane lipid saturation activates endoplasmic reticulum unfolded protein response transducers through their transmembrane domains[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(12):4628-4633.

[17] Mizushima N. Methods for monitoring autophagy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004,36(12):2491-2502.

[18] Ameri K, Harris AL. Activating transcription factor 4[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008,40(1):14-21.