趙靜，張家明，杜雅瑩，李興睿

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院，武漢430000)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，約占所有內(nèi)分泌相關(guān)惡性腫瘤的95%[1]，按其惡性程度可分為分化良好的甲狀腺癌(WDTC)、低分化甲狀腺癌(PDTC)和未分化甲狀腺癌(ATC)。多數(shù)甲狀腺癌發(fā)展緩慢，患者整體預(yù)后較好。ATC是惡性程度最高的甲狀腺癌，發(fā)病率約占甲狀腺癌總發(fā)病率的2%[2]，其特點為發(fā)病突然、進展迅速和預(yù)后極差，確診時多已出現(xiàn)周圍組織器官侵犯，15%～50%的患者伴肺、骨、腦、肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]，患者中位生存期僅3～6個月，5年生存率低于10%[4]。由于ATC失分化而無攝碘能力，其生長不受促甲狀腺激素的影響，因而放射性131I治療和促甲狀腺激素抑制治療均無明顯效果[5]，此外，大部分ATC難以完全切除，且對放化療敏感性較低。因此，分子靶向治療有望成為ATC治療的發(fā)展方向之一。生物信息學(xué)是一門結(jié)合分子生物學(xué)與計算機信息技術(shù)的新型交叉學(xué)科，基因表達(dá)譜芯片是一種高效率、大規(guī)模獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)的技術(shù)。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法分析基因表達(dá)譜芯片，可實現(xiàn)在全基因組水平上進行大規(guī)模、高通量、高靈敏度、高精確度的基因序列測定及功能研究。本研究通過對美國國家生物信息中心(NCBI)GEO數(shù)據(jù)庫中的ATC基因表達(dá)譜芯片進行挖掘，篩選得到ATC與正常甲狀腺組織的差異表達(dá)基因(DEGs)，對差異基因進行功能富集、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等生物信息學(xué)分析，初步預(yù)測靶向作用于差異基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和microRNA，進一步在ATC細(xì)胞系與正常甲狀腺組織細(xì)胞系表達(dá)譜芯片中驗證關(guān)鍵DEGs和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，初步從分子水平探究ATC發(fā)病機制、尋找潛在的ATC治療靶點。

1　 材料與方法

1.1芯片來源 基因表達(dá)譜芯片來源于美國國家生物信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，3組芯片均為全基因組RNA表達(dá)譜芯片，序列號分別為GSE65144、GSE53072和GSE9115。GSE65144由von Roemeling CA等提交，研究包括12例人類ATC組織樣本及與之配對或非配對的13例正常甲狀腺組織樣本。GSE53072由Pita等提交，研究包括5例人類ATC組織樣本(3例樣本來自術(shù)中冰凍切片，3例樣本來自細(xì)針穿刺組織)，3例配對的正常甲狀腺冰凍切片樣本和1例人類正常甲狀腺組織RNA雜交池樣本。GSE9115由Salvatore G等提交，研究包括5例人類ATC組織樣本和4例正常甲狀腺組織樣本。

1.2數(shù)據(jù)處理及差異基因篩選從GEO數(shù)據(jù)庫中下載原始芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)，使用R軟件(version 3.3.3)及R Bioconductor軟件的affty、limma、ggplot2、VennDiagram等軟件包，對表達(dá)譜數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制、背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)匯總，使用經(jīng)驗貝葉斯分析方法篩選出ATC和正常甲狀腺組織的差異表達(dá)基因。選取差異倍數(shù)(FC)和校正后P作為篩選指標(biāo)，以|log FC|>1且adjustP<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別選取3組芯片數(shù)據(jù)中表達(dá)差異顯著的基因合并取交集后，得到267個差異基因作為研究對象。

1.3差異基因富集分析及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析將267個差異基因?qū)朐诰€富集分析數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov)，分別從生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分三個方面進行在線功能富集GO分析，應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫KEGG(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html )對差異基因進行生物學(xué)信號通路富集分析。通過STRING在線分析平臺(https://string-db.org )構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，分析差異基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，應(yīng)用Cytoscape軟件(version 3.5.0)及其插件CytoHubba和MCODE對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化和分析，計算單個蛋白質(zhì)節(jié)點與其他節(jié)點間的相互作用關(guān)系強度，評估蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系的密切程度，并創(chuàng)建PPI子網(wǎng)絡(luò)。

1.4轉(zhuǎn)錄因子-差異基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析和microRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析使用數(shù)據(jù)庫WebGstalt(http://www.webgestalt.org/option.php )預(yù)測microRNA與差異基因轉(zhuǎn)錄后mRNA的靶向作用關(guān)系，構(gòu)建microRNA-mRNA靶向作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測ATC中發(fā)揮關(guān)鍵作用的microRNA。

1.5ATC細(xì)胞系中潛在靶點基因表達(dá)的驗證從GEO數(shù)據(jù)庫中下載原始芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE85457，該芯片由Weinberger 等提交，樣本包括四個ATC細(xì)胞系和三個正常甲狀腺細(xì)胞系。通過R軟件(version 3.3.3)及R Bioconductor軟件的affty、limma軟件包和Affymetrix Expression Console Software(verversion1.4)，使用經(jīng)驗貝葉斯分析方法計算ATC細(xì)胞系和正常甲狀腺細(xì)胞系的基因表達(dá)水平，得到基因表達(dá)差異熱圖，并與ATC組織中預(yù)測得到的重要DEGs和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)水平進行對比驗證，進一步證實潛在靶點基因在ATC中的表達(dá)水平，提高預(yù)測的可信度。

2　 結(jié)果

2.1篩選的差異基因3組芯片差異基因分別篩選取交并集后共有273個表達(dá)差異基因，其中共同表達(dá)上調(diào)基因108個，共同表達(dá)下調(diào)基因159個，共267個表達(dá)差異基因。

2.2富集分析和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 DAVID數(shù)據(jù)庫GO富集分析結(jié)果顯示，差異基因主要參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢查點、有絲分裂中的核分裂和胞質(zhì)分裂、DNA復(fù)制、細(xì)胞缺氧反應(yīng)、細(xì)胞間黏附作用、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程，差異基因主要與細(xì)胞質(zhì)、外泌體、細(xì)胞膜、細(xì)胞中心體、著絲粒等細(xì)胞組分有關(guān)，其主要分子功能為ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。KEGG信號通路分析顯示，差異基因富集得到的信號通路主要有細(xì)胞周期、吞噬、精氨酸和脯氨酸代謝和HIF-1信號通路。通過對差異基因編碼的蛋白質(zhì)進行STRING在線分析、Cytoscape軟件可視化處理，得到包含179個蛋白質(zhì)節(jié)點和561條互作線的蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，有一部分蛋白質(zhì)節(jié)點與其他節(jié)點有較多連接，稱之為中心節(jié)點(HUB)。使用Cytoscape插件CytoHubba計算蛋白節(jié)點間相互作用關(guān)系，得到相互作用關(guān)系度最高的10個中心節(jié)點， BUB1、CCNB2、AURKA、CCNA2、BUB1B、CDC6、CDH1、KIF23、CENPA和KIF2C。

2.3轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析和microRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析通過在線數(shù)據(jù)庫WebGstalt預(yù)測靶向作用于差異基因的轉(zhuǎn)錄因子和作用于差異基因mRNA的microRNA，Cytoscape可視化處理后得到轉(zhuǎn)錄因子-基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)(圖1)和microRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)(圖1)，其中轉(zhuǎn)錄因子E2F、NFY、HFH4和E2F1DP2與差異基因相互作用關(guān)系密切，可能是ATC中調(diào)節(jié)差異基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。microRNA15a、microRNA15b、microRNA16、microRNA195、microRNA424和microRNA497等與18個差異基因mRNA存在相互作用關(guān)系，可能通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后的mRNA水平，在ATC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2.4ATC細(xì)胞系中潛在靶點基因的表達(dá)驗證 ATC組織中預(yù)測得到的潛在靶點基因，包括重要的DEGs(BUB1、CCNB2、AURKA、CCNA2、BUB1B、CDC6、CDH1、KIF23、CENPA、KIF2C)和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子E2F、NFY。在ATC細(xì)胞系中，重要的DEGs表達(dá)水平與其在ATC組織中的表達(dá)水平一致，均呈表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子E2F1、E2F2、E2F7、E2F6在ATC細(xì)胞系中表達(dá)均上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子NFY在ATC細(xì)胞系中的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。進一步驗證了ATC與正常甲狀腺組織中預(yù)測所得潛在靶點基因的表達(dá)。

注：A:轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò);B:microRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

圖1轉(zhuǎn)錄因子-基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)

3　 討論

本研究通過生物信息學(xué)的方法篩選得到267個ATC與正常甲狀腺組織的差異基因，其中表達(dá)上調(diào)基因108個，表達(dá)下調(diào)基因159個?；蚋患治霭l(fā)現(xiàn)，差異基因主要參與細(xì)胞分裂增殖、細(xì)胞間黏附作用和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程。細(xì)胞異常分裂和增殖失控是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而細(xì)胞間黏附降低和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化則在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程中起到重要作用。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞以鵝卵石樣上皮表型向狹長狀成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)換并獲得間質(zhì)表型過程，不僅參與腫瘤的遷移和侵襲，且與細(xì)胞抗衰老、抗凋亡和腫瘤細(xì)胞耐藥、耐放療等密切相關(guān)[6]。KEGG富集分析表明，差異基因主要涉及2條腫瘤相關(guān)通路：細(xì)胞周期相關(guān)通路和HIF-1信號通路。由于腫瘤細(xì)胞惡性增殖速率過快，局部血管網(wǎng)無法為瘤體提供充足氧氣從而形成了局部缺氧的微環(huán)境[7]。HIF-1是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)控一系列與缺氧有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，使癌細(xì)胞克服缺氧環(huán)境。另外，HIF-1促進選擇性的線粒體自噬，誘導(dǎo)多能性腫瘤干細(xì)胞生成，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低E-cadherin表達(dá)等，從而促進腫瘤的生長和進展[8]。

通過對差異基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用進行分析，構(gòu)建出以BUB1、CCNB2、AURKA、CCNA2、BUB1B、CDC6、CDH1、KIF23、CENPA、KIF2C等為中心節(jié)點構(gòu)成的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。BUB1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，調(diào)控細(xì)胞周期和染色體內(nèi)聚，在有絲分裂中起到核心作用。BUB1還具有調(diào)控TGF-β通路的重要作用，正常情況下TGF-β是腫瘤抑制因子，BUB1與TGF-β受體結(jié)合導(dǎo)致TGF-β轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤促進因子，刺激正常細(xì)胞異常增殖進而惡變，促進腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[9]。CCNB2是細(xì)胞周期蛋白家族的一員，在細(xì)胞分裂的G2/M期進展中起關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)CCNB2在膀胱癌[10]、非小細(xì)胞肺癌[11]等惡性腫瘤中均為高表達(dá)。PPI第1個子網(wǎng)絡(luò)中，表達(dá)上調(diào)的蛋白PBK、KIFC1、TTK、NEK2、KIF2C、CHEK1、AURKA、CDC7、BUB1均屬于細(xì)胞分裂蛋白激酶家族，在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控中有重要作用，蛋白激酶過度激活可引起細(xì)胞異常增殖分化。第2個子網(wǎng)絡(luò)中，表達(dá)上調(diào)的蛋白NUSAP1、ZWILCH、CENPI、CENPF、CENPA、TPX2、ZWINT、MCM6均與細(xì)胞有絲分裂過程中染色體、紡錘體等細(xì)胞器相關(guān)，表明與正常細(xì)胞相比，ATC存在異常旺盛的細(xì)胞分裂和增殖。

轉(zhuǎn)錄因子可與基因特定序列靶向結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的時間空間表達(dá)及表達(dá)強度。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，轉(zhuǎn)錄因子E2F在差異基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到重要作用。轉(zhuǎn)錄因子E2F在調(diào)控細(xì)胞周期進程方面具有重要作用，通過調(diào)控G1/S期DNA合成所需的時相基因控制細(xì)胞周期過程。WebGstalt在線數(shù)據(jù)庫是基于網(wǎng)絡(luò)的整合數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)，可預(yù)測靶向結(jié)合并調(diào)節(jié)差異基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子-mRNA靶向作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測ATC中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，E2F與腫瘤發(fā)生發(fā)展、血管新生、轉(zhuǎn)移等有關(guān)，與乳腺癌預(yù)后密切相關(guān)[12]，因此ATC發(fā)病可能與E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性失調(diào)有關(guān)。microRNA為一類轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，通過作用于基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA來調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)。microRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，microRNA-15家族參與調(diào)節(jié)凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、代謝等，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[13]。

綜上所述，通過對ATC芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，初步預(yù)測基因BUB1、CCNB2、AURKA、CCNA2、BUB1B、CDC6、CDH1、KIF23、CENPA、KIF2C及轉(zhuǎn)錄因子E2F和microRNA-15家族有望成為ATC分子靶向治療潛在靶點。

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