甘魯慧，呂沐瀚，鄧明明

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

肝細(xì)胞癌近年發(fā)病率高，是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。其中，肝細(xì)胞癌的高異質(zhì)性是導(dǎo)致癌細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的關(guān)鍵因素[2]。因此，闡釋其侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制是防治肝細(xì)胞癌的關(guān)鍵。文獻(xiàn)證實(shí)，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞丟失細(xì)胞間連接而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的生物轉(zhuǎn)化過程，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要特征，而通過調(diào)控EMT可促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號(hào)通路參與生物體內(nèi)細(xì)胞的增殖、發(fā)育[4]，Hedgehog信號(hào)激活通路中關(guān)鍵蛋白Gli1轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),干預(yù)下游靶基因參與調(diào)控EMT。在下游的核轉(zhuǎn)錄因子中，Twist1在轉(zhuǎn)錄水平上抑制E-Cadherin表達(dá)，誘導(dǎo)EMT形成[5]。然而，Gli1是否會(huì)通過Twist1而實(shí)現(xiàn)調(diào)控人肝癌細(xì)胞的增殖遷移尚不清楚。2017年9月，我們通過篩選Gli1高表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建穩(wěn)定的GLi1siRNA，探討Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Gli1對人肝癌細(xì)胞中Twist1蛋白表達(dá)及增殖遷移的影響。

1　材料與方法

1.1材料 Huh7、hepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五種人肝癌細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。根據(jù)網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得Gli1基因的cDNA序列，采用在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)siRNA，經(jīng)BLAST比對分析與人類其他基因編碼序列無同源性，在候選靶序列中選取3條序列：GLi1siRNA1:5′-GCACCAAACGCTATACAGA-3′;GLi1siRNA2:5′- CTCCACAGGCATACAGGAT-3′;GLi1siRNA3:5′-TCATACTCACGCCTCGAAA-3′，設(shè)計(jì)陰性對照，由廣州銳博生物公司合成。兔抗人Gli1、Twist1、E-cadherin、N-Cadherin和Vimentin單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體及二抗均購自美國Santa Cruz公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、擴(kuò)增試劑盒(SYBR ? Premix Ex TaqTM Ⅱ)(TaKaRa 公司)。

1.2細(xì)胞系Gli1蛋白表達(dá)檢測采用Western blotting技術(shù)，主要操作流程參照文獻(xiàn)[6]。移除細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS液洗3次，加入蛋白裂解液后冰浴超聲勻漿30 min，4 ℃，12 000 g離心15 min，去除上清液，BCA法測定各組蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。取40 μg總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠分離，冰水環(huán)境、40 V恒壓轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST漂洗后加入Gli1一抗(1∶1 000)，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜3次后加入二抗37 ℃ 2 h。TBST清洗后于Image Lab系統(tǒng)下顯影成像，以目的蛋白/GAPDH條帶灰度值作為其相對表達(dá)量。

1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參考文獻(xiàn)[7]，將1.2步驟中篩選的Gli1高表達(dá)人肝癌細(xì)胞系于生長對數(shù)期時(shí)，將3個(gè)重組質(zhì)粒(廣州銳博生物公司提供)轉(zhuǎn)染，分別為pGCsi-U6-GLi1siRNA-1(siRNA-1組)、pGCsi-U6-GLi1siRNA-2(siRNA-2組)、pGCsi-U6-GLi1siRNA-3(siRNA-3組)，而空白對照組(N組)不轉(zhuǎn)染任何序列，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照序列(NC組)。各組質(zhì)粒DNA均采用4 μg，6 h后棄轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入 DMEM/F12條件培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4Gli1 mRNA相對表達(dá)量檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，操作步驟：于培養(yǎng)48 h后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用TRIzol法提取總RNA，用ddH2O稀釋1 μL樣品200倍后測定RNA濃度與純度。引物由Primer軟件設(shè)計(jì)、Takara公司合成，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明 ，42 ℃反轉(zhuǎn)錄50 min，95 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。Gli正向引物:5′-CCAGCCAGAGAGACCAACAG-3′,反向引物:5′-CCCGCTTCTTGGTCAACTT-3′,GAPDH正向引物:5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′,反向引物:5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′，其反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2X)12.5 μL、正反向引物各1 μL、cDNA 2 μL和dH2O 8.5 μL，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。定量分析mRNA采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。Western blotting技術(shù)主要操作流程同1.2步驟。

1.5細(xì)胞遷移距離測算進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[8]，用10 μL的槍頭在下室細(xì)胞中垂直與6孔板劃兩條垂直交叉的劃痕，PBS清洗每孔3次，清洗劃掉的細(xì)胞，然后加入無血清培養(yǎng)液，用倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)拍照，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次拍照。用倒置熒光顯微鏡拍照內(nèi)置軟件(cellSens Standard)計(jì)算出細(xì)胞遷移距離。

1.6細(xì)胞中Twist1蛋白、E-Cadherin蛋白表達(dá)檢測采用Western blotting技術(shù)。主要操作流程同1.2步驟。其中Twsit1一抗稀釋度為1∶1 000，E-Cadherin一抗稀釋度為1∶1 000。

2　結(jié)果

2.1五種高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞中Gli1蛋白表達(dá)比較 Gli1蛋白在五種高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞Huh7、SMMC-7721、PLC、HepG2、Bel-7404中相對表達(dá)量分別為0.12±0.04、0.39±0.08、0.41±0.05、0.38±0.06、0.76±0.13，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，Gli1蛋白在Bel-7404細(xì)胞中相對表達(dá)量高于其他細(xì)胞中(P均<0.05)，Gli1蛋白在Huh7細(xì)胞中相對表達(dá)量低于SMMC-7721、PLC、HepG2細(xì)胞中(P均<0.05)，Gli1蛋白在SMMC-7721、PLC、HepG2細(xì)胞中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)比較選擇Gli1蛋白表達(dá)量最高的Bel-7404細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，N組、NC組、GLi1siRNA1組、GLi1siRNA2組、GLi1siRNA3組細(xì)胞中Gli1蛋白相對表達(dá)量分別為0.64±0.08、0.60±0.03、0.18±0.05、0.07±0.02、0.19±0.02。三種GLi1siRNA對Gli1蛋白抑制率分別為71.86%、89.06%、70.77%(P=0.000)。經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，Gli1蛋白在GLi1siRNA2組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中相對表達(dá)量低于其他組(P均<0.05)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，N組、NC組、GLi1siRNA1組、GLi1siRNA2組、GLi1siRNA3組細(xì)胞中Gli1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.85±0.12、0.80±0.06、0.37±0.07、0.15±004、0.35±0.05。三種GLi1siRNA均對Gli1 mRNA產(chǎn)生了較好的抑制效果，抑制率分別為75.74%、90.06%、71.52%(P=0.000)。Gli1 mRNA在GLi1siRNA2組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中相對表達(dá)量低于其他組(P均<0.05)。

2.3細(xì)胞遷移距離比較將篩選的Gli1抑制效果最佳的GLi1siRNA2組細(xì)胞、N組細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)比較，在劃痕24 h后，與N組比較，GLi1siRNA2組細(xì)胞的劃痕間距值增加，細(xì)胞的遷移距離降低(P均<0.05)，提示GLi1siRNA2組細(xì)胞的遷移、修復(fù)能力降低。N組、GLi1siRNA2組細(xì)胞的劃痕間距值分別為(103.87±16.39)、(458.78±40.55)μm。

2.4EMT相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果N組、GLi1siRNA2組Twsit1蛋白相對表達(dá)量分別為1.12±0.15、0.53±0.12，E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量分別為0.22±0.05、0.72±0.14，N-Cadherin蛋白相對表達(dá)量分別為0.81±0.11、0.26±0.04，Vimentin蛋白相對表達(dá)量分別為0.66±0.14、0.17±0.03，GLi1蛋白相對表達(dá)量分別為0.65±0.08、0.17±0.03。經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，與N組比較，GLi1siRNA2組的Twsit1、GLi1、N-Cadherin和Vimentin蛋白相對表達(dá)量降低，E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3　討論

Hedgehog信號(hào)通路在腫瘤的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、侵襲轉(zhuǎn)移等病理生理過程發(fā)揮重要作用，甚至與腫瘤耐藥密切相關(guān)[9]。在人肝細(xì)胞癌中，Hedgehog信號(hào)通路中的Gli1在臨床肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本中有較高的陽性表達(dá)率且與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能作為判斷肝細(xì)胞癌惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)[10]?；A(chǔ)研究證實(shí)[11]，阻擋Gli1可抑制人肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。為研究Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Gli1對人肝癌細(xì)胞中Twist1蛋白表達(dá)及增殖遷移的影響，我們通過在 Huh7、HepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五種細(xì)胞中，通過Western blotting篩選出Gli1高表達(dá)的Bel-7404進(jìn)行了siRNA干預(yù)，在設(shè)計(jì)的三組siRNA中，挑選抑制Gli1效率最高的組進(jìn)行分析Bel-7404細(xì)胞Twist蛋白表達(dá)情況和遷移修復(fù)能力。本研究結(jié)果顯示，通過siRNA沉默Gli1后，成功抑制了人肝癌Bel-7404細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，此與Chen等[12]研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，Gli1產(chǎn)生這種效應(yīng)的機(jī)制可能與在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)轉(zhuǎn)化因子β1受體、C端結(jié)合蛋白2[13]等促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT。而Twist1可顯著性促進(jìn)癌細(xì)胞EMT[14]，抑制Twist1可限制腫瘤轉(zhuǎn)移甚至逆轉(zhuǎn)其耐藥性[15]，這可能與Twist1作用于PcG家族中的Bmi1基因促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞向干細(xì)胞分化[16]，而Twist1又可接受腫瘤微環(huán)境中促炎性因子TNF-α通過經(jīng)典的NF-κB通路誘導(dǎo)[17]，形成一個(gè)正反饋放大通路。但Twist1表達(dá)是否接受Gli1調(diào)控仍未知。在本研究中通過抑制Gli1的同時(shí)，Twist1表達(dá)量顯著性下調(diào)，而人肝癌Bel-7404細(xì)胞中EMT的特征性蛋白E-Cadherin卻表達(dá)增加，N-Cadherin和Vimentin下調(diào)。提示Gli1可能作用于Twist1而實(shí)現(xiàn)EMT的調(diào)節(jié)。

Gli1是Hedgehog信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，Hedgehog信號(hào)通路與腫瘤的細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。而Twist1可顯著性促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT[14]，上皮間質(zhì)化是肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因，在出現(xiàn) EMT 時(shí),可視為肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的開始。在EMT過程中的特征性變化包括：上皮細(xì)胞的標(biāo)志E-Cadherin下調(diào)、β-catenin 的核轉(zhuǎn)位聚集，間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志N-Cadherin、Vimentin上調(diào)等[16,17]。

綜上所述，siRNA沉默Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Gli1后，Twist1下調(diào)，EMT抑制，提示在人肝癌細(xì)胞Bel-7404中，Hedgehog/Gli1通路可能通過作用于Twist1而實(shí)現(xiàn)EMT的調(diào)節(jié)，此將為肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制研究與防治工作提供參考。但本研究尚未觀察Gli1與Twist1的相互作用，亦未驗(yàn)證肝癌臨床標(biāo)本中二者在病理檢測中的相關(guān)性，有待于后續(xù)探究。

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