黃攀，徐敏，何曉英,王淳

(1 德陽市人民醫(yī)院，四川德陽618000；2 德陽市第二人民醫(yī)院；3 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

重癥肌無力(MG)是一種由于神經(jīng)-肌肉接頭突觸后膜上乙酰膽堿受體(AChR)受損導(dǎo)致的神經(jīng)-肌肉接頭傳遞功能障礙性疾病[1]。其主要臨床表現(xiàn)為部分或全身骨骼肌無力，易疲勞，活動(dòng)后癥狀加重，充分休息或膽堿酯酶抑制劑治療后癥狀可減輕。MG病情易反復(fù)并可出現(xiàn)多種危象，給社會(huì)和家庭造成沉重負(fù)擔(dān)。目前認(rèn)為，MG是一種與遺傳因素有關(guān)的獲得性自身免疫性疾病[2]。microRNA是一類長(zhǎng)度為17～22個(gè)核苷酸的單鏈小分子物質(zhì)，通過完全或非完全堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與特定靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制mRNA翻譯或降解其特定mRNA，繼而參與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生的調(diào)控[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-146a在多種免疫性疾病中存在差異表達(dá)[4，5]，提示其具有調(diào)控炎癥免疫反應(yīng)的作用，但鮮見MG患者microRNA-146a差異表達(dá)情況的報(bào)道。因此，本研究觀察了MG患者血清micro-RNA-146a水平變化，并通過生物信息學(xué)方法分析microRNA-146a靶基因的功能富集和信號(hào)通路富集情況，以期從基因?qū)W角度進(jìn)一步闡述MG的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年7月～2018年1月德陽市人民醫(yī)院收治的MG患者108例(MG組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合重癥肌無力診斷和治療的中國(guó)專家共識(shí)[6]；②首次確診且未行治療；③臨床資料完整；④神志清楚，能配合本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫性疾病；②正在使用抑制免疫功能的藥物；③合并嚴(yán)重內(nèi)科系統(tǒng)疾?。虎芎喜⑵渌窠?jīng)-肌肉疾病。其中，男47例、女61例，年齡(37.47±8.21)歲。另選同期體檢健康者50例(對(duì)照組)，男20例、女30例，年齡(39.25±8.34)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)德陽市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 血清microRNA-146a檢測(cè) 空腹采集外周靜脈血5 mL，室溫下自然凝固15 min，3 000 r/min離心30 min，收集上層血清。主要試劑和儀器：TRIzol Reagent、10 mmol/L dNTP Mix、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq購(gòu)于日本TaKaRa公司；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司；PCR儀購(gòu)于杭州博日科技有限公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠。檢測(cè)方法：①血清總RNA提取及質(zhì)檢。取200 μL血清置于冰上融化，加入1 mL TRIzol，充分混勻，靜置5 min后加入三氯甲烷250 μL，再充分混勻，置于冰上靜置5 min。將上述混合液4 ℃下以10 000 g離心10 min，在超凈工作臺(tái)中小心吸取上清500 μL于1.5 mL EP管中；加入4 ℃預(yù)冷的等體積異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃靜置15 min。將上述溶液在4 ℃下以10 000 g離心10 min，小心棄掉液體；加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的75%乙醇，顛倒數(shù)次，清洗RNA沉淀；再于4 ℃下以10 000 g離心5 min，棄掉液體；于超凈工作臺(tái)中干燥數(shù)分鐘，將乙醇充分揮發(fā)干凈，加入10 μL RNase-Free Water溶解RNA。采用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定所提取RNA的OD260、OD280值，OD260/OD280為1.8～2.0，表明所提取的RNA純度較高。②RT-PCR反應(yīng)。第一鏈cDNA的合成采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，將內(nèi)參基因和目的基因特異性逆轉(zhuǎn)錄引物各1.0 μL、dNTP Mix 1.0 μL、RNA 10 μL、5×第一鏈合成緩沖液4.0 μL、DTT 2.0 μL、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，按說明書置于反應(yīng)體系中，按照95 ℃ 5 min、37 ℃ 50 min的方式反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將前述制備的反應(yīng)混合液置于96孔板中，按操作步驟加入2×qPCR Mix 5.0 μL、引物工作液1.0 μL、Template 1.0 μL、ddH2O 2.8 μL、Rox 0.2 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃ 1 min;95 ℃、15 s，58 ℃、20 s，72 ℃、45 s，共40個(gè)循環(huán)。microRNA-146a上游引物5′-CCTGAGAAGTGAATTCCATGGG-3′、下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′，內(nèi)參基因U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔCt法計(jì)算microRNA-146a相對(duì)水平。

1.3 microRNA-146a生物信息學(xué)分析 采用美國(guó)加州大學(xué)圣克魯茲分校研制的UCSC基因組在線工具(http://genome-asia.ucsc.edu)分析microRNA-146a在人類基因組中的位置及保守性；運(yùn)用Targetscan數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_72/)及CoMeTa數(shù)據(jù)庫(https://www.cometasystems.com/)預(yù)測(cè)microRNA-146a的靶基因；采用DAVID數(shù)據(jù)庫分析microRNA-146a靶基因的功能富集(GO富集)和信號(hào)通路富集(KEGG Pathway)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清microRNA-146a水平比較 MG組血清microRNA-146a相對(duì)水平為2.13±0.63，高于對(duì)照組的0.86±0.38(P<0.05)。

2.2 microRNA-146a在人類基因組中的位置及保守性 microRNA-146a定位于5q33.3人染色體上160485325～160485450，長(zhǎng)度為99 bp，并且其核苷酸序列在人、恒河猴、小鼠、狗、大象、雞6個(gè)物種中高度保守。

2.3 microRNA-146a靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 使用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)microRNA-146的靶基因共251個(gè)，而CoMeTa數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶基因共939個(gè)。兩個(gè)數(shù)據(jù)庫同時(shí)出現(xiàn)的靶基因有88個(gè)(ERBB4、IRAK1、WWC2、TAF9B、USP47、ABL2、BMPR1A、CDC14A、CLCN6、RNF32、ZNF148、MYO6、MARK1、SORT1、IGSF1、MMP16、SLC2A3、SEC23IP、CNTF、NRP2、QKI、BAG1、ARMC8、RARB、TDRKH、NRAS、FRYL、FBXW2、GRSF1、C10orf76、PHOX2B、MYT1、CAMSAP1、FLOT2、CCDC6、STC1、SEMA3G、TCF21、TANC2、LTB、EDNRB、ROBO1、EIF5A2、RABGAP1、RUNX1T1、LRRC15、SMAD4、VAT1、POU3F2、LFNG、BNC1、MYBL1、SYT1、SIAH2、TRAF6、DGKG、KLF7、CD80、CDON、BCORL1、CARD10、DNPEP、SLI1、TRK3、RNASEL、C16orf72、LRP2、PRX、KCMF1、NUMB、KIF24、ZNF532、PPP1R11、RIMS2、NOVA1、DLGAP2、SH3GL2、EIF4G2、MFHAS1、FBXO28、KPNA6、NF2、STRN、CASK、PBX2、SLC10A3、USP3、SCN3B、PGK1)。這些靶基因在基因轉(zhuǎn)錄、免疫球蛋白、炎癥反應(yīng)、鈣調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白生成、突觸分化等過程中發(fā)揮重要作用。

2.4 microRNA-146潛在靶基因的功能富集 采用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)88個(gè)交集潛在靶基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)microRNA-146a靶基因功能主要富集于細(xì)胞增殖調(diào)控、神經(jīng)元分化、磷代謝反應(yīng)、免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子合成等22個(gè)生物學(xué)過程中。見表1。

表1 microRNA-146a靶基因GO分析結(jié)果

2.5 microRNA-146潛在靶基因的信號(hào)通路富集 microRNA-146a靶基因主要富集于Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤信號(hào)通路、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)信號(hào)通路、病毒性心肌炎信號(hào)通路、EB信號(hào)通路5條信號(hào)通路中。其中，Toll受體是一種與免疫及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的信號(hào)通路，且已經(jīng)被證實(shí)與MG發(fā)病有關(guān)。見表2。

3 討論

1895年Jolly首次命名了MG，其后相關(guān)報(bào)道逐漸增多[7]。MG最初被認(rèn)為是一種AChR抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，該抗體可引起突觸后膜大量的AChR被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致終板電位不能產(chǎn)生，最終因突觸后膜傳遞功能障礙而出現(xiàn)肌無力表現(xiàn)[8]。近年來，隨著家族性MG的發(fā)現(xiàn)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到MG與人類白細(xì)胞抗原關(guān)系密切，由此推測(cè)MG是一種與遺傳因素密切相關(guān)的自身免疫性疾病[9，10]。但目前MG與遺傳因素的研究較少。因此，有必要進(jìn)一步對(duì)MG發(fā)病的遺傳因素進(jìn)行研究。

表2 microRNA-146a潛在靶基因KEGG Pathway結(jié)果

microRNA是一類具有重要調(diào)控作用的非編碼小分子RNA，在人體內(nèi)通過與其特定靶基因的結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控多條信號(hào)通路的作用，免疫炎癥反應(yīng)信號(hào)通路便是其中之一。microRNA-146a被認(rèn)為具有調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-146a可通過抑制TRAF6/NF-κB信號(hào)通路減輕腰椎間盤的炎癥反應(yīng)[11]；另有研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病患者腦中，下調(diào)的microRNA-146a可以通過TLR信號(hào)途徑促進(jìn)固有免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)阿爾茨海默病的發(fā)生[12]。本研究中，通過對(duì)比MG患者和體檢健康者外周血清microRNA-146a水平發(fā)現(xiàn)，MG患者血清microRNA-146a水平明顯高于體檢健康者，提示microRNA-146a可能與MG的發(fā)病密切相關(guān)，這與Yan等[13]的研究結(jié)論相似。

microRNA通過與特定靶基因mRNA結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。為進(jìn)一步明確microRNA-146a潛在的靶基因，我們采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。目前，microRNA靶基因的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫眾多，TargetScan數(shù)據(jù)庫和CoMeTa數(shù)據(jù)庫是較為常用的兩種。本研究通過繪制Venn圖[14]，取以上兩種數(shù)據(jù)庫的交集作為microRNA-146a潛在靶基因，大大提高了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，microRNA-146a潛在的靶基因有ERBB4、NUMB、CD80、TRAF6、IRAK1等88種。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)是一種神經(jīng)元來源的營(yíng)養(yǎng)因子，具有支持神經(jīng)肌肉發(fā)育的作用，而ERBB4則是NRG的受體之一[15]。此外，NRG-ERBB4信號(hào)通路還在突觸的形成及軸突導(dǎo)向的調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用。有研究還發(fā)現(xiàn)，microRNA-146a可以調(diào)控ERBB4的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖[16]。p53是一種眾所周知的抑癌基因，NUMB基因的表達(dá)產(chǎn)物NUMB蛋白可以抑制p53的活性進(jìn)而增加小腸腺癌組織中的免疫活性[17]。T細(xì)胞的活化是免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要過程，而免疫突觸的形成在T細(xì)胞活化過程中具有重要作用，CD80是免疫突觸形成過程中重要的協(xié)同刺激分子[18]。TRAF6是TLR信號(hào)通路的主要介導(dǎo)因子，廣泛參與介導(dǎo)炎癥與免疫反應(yīng)[19]。IRAK1是介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的TLR和白細(xì)胞介素1受體信號(hào)通路中的重要分子[20]。

對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析，有利于尋找和預(yù)測(cè)與疾病發(fā)生有關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。DAVID6.7數(shù)據(jù)庫是常用的預(yù)測(cè)軟件。本研究采用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)microRNA-146a靶基因功能GO富集發(fā)現(xiàn)，相關(guān)靶基因分子主要富集于細(xì)胞增殖調(diào)控、神經(jīng)元分化、磷代謝反應(yīng)、免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子合成等生物學(xué)過程中；而KEGG Pathway結(jié)果顯示，microRNA-146a主要富集于TLR[21]、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)、病毒性心肌炎、EB等多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路。研究表明，TLR家族中的TLR9與MG發(fā)病關(guān)系密切，TLR9可以通過TRAF6和CD88途徑促進(jìn)INF-α表達(dá)，進(jìn)一步激活自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，從而導(dǎo)致MG的發(fā)病[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，MG患者胸腺組織EB病毒含量較正常人增高，提示EB病毒與自身免疫性疾病有一定關(guān)系，但具體關(guān)系還需進(jìn)一步研究證實(shí)[23，24]。

綜上所述，MG患者血清microRNA-146a水平升高；通過生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，microRNA-146a可能通過調(diào)控多條信號(hào)通路中的多種靶基因，參與MG的發(fā)病。這為進(jìn)一步闡明MG發(fā)病過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了更多的依據(jù)。但本研究樣本量較少且為單中心研究，其結(jié)論可能存在一定偏倚，今后需更多大樣本、多中心研究進(jìn)行驗(yàn)證。