馬國(guó)維，鐘欣，杜可，宮世強(qiáng)，劉明妍，魏敏杰

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110122)

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為記憶力逐漸減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常和社交障礙等[1，2]。早期明確診斷可大大減輕AD患者家庭負(fù)擔(dān)和醫(yī)療系統(tǒng)壓力[3]。然而目前主流的檢測(cè)方法,如簡(jiǎn)易智能狀態(tài)檢查量表、CT或MRI檢查、18F-脫氧核糖葡萄糖正電子掃描、腦電圖、生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)等[4～7]，均存在一定局限性。近年來(lái)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和計(jì)算機(jī)技術(shù)在腫瘤研究的各個(gè)方面取得較大進(jìn)展[8]，我們通過生物信息學(xué)分析，嘗試對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行分析探討。近年來(lái)能量代謝是AD發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)[9]。生物能量缺陷是與腦老化和AD相關(guān)認(rèn)知衰退的主要原因之一[10，11]。大腦利用全身約25%的葡萄糖，其中大部分通過糖酵解和線粒體氧化磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)能量以支持突觸傳遞[12]。糖酵解是所有生物體進(jìn)行葡萄糖分解代謝所必須經(jīng)過的共同階段，其中磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(GPI)基因表達(dá)障礙可能使大腦對(duì)葡萄糖的利用和代謝產(chǎn)生影響。在細(xì)胞質(zhì)中，GPI基因在糖酵解和糖異生途徑中起關(guān)鍵作用；在細(xì)胞外，GPI基因是脊髓和感覺神經(jīng)元的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并且作為誘導(dǎo)免疫球蛋白分泌的淋巴因子而發(fā)揮作用[13]。鑒于上述背景，2017年7月～2018年8月，本研究通過Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)，觀察了在AD患者腦組織與外周血GPI基因表達(dá)變化，并分析GPI基因的功能及其與AD發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 腦組織、外周血標(biāo)本來(lái)源 健康老年人大腦額葉皮質(zhì)樣本18例份、顳葉皮質(zhì)樣本19例份、海馬樣本19例份、外周血樣本14例份及AD患者大腦額葉皮質(zhì)樣本15例份、顳葉皮質(zhì)樣本10例份、海馬樣本29例份、外周血樣本14例份。外周血樣本來(lái)自加拿大魁北克省蒙特利爾市部分醫(yī)院、診所和老年人護(hù)理院。腦組織樣本分別來(lái)源于美國(guó)肯塔基大學(xué)阿爾茨海默病研究中心的腦庫(kù)尸檢標(biāo)本與2008年12月15日～2011年2月24日獲得的日本Hisayama市居民尸檢樣本。

1.2 GPI基因檢測(cè) 采用GEO芯片技術(shù)。通過NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，篩選出GDS810、GDS4758、GDS2601三個(gè)AD相關(guān)芯片，芯片分別采用GPL96[HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array、GPL6244 [HuGene-1_0-st] Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array [transcript (gene) version]、GPL1211-NIA MGC下載并預(yù)處理GPI基因表達(dá)資料。各待檢樣本中GPI表達(dá)量通過R語(yǔ)言編寫的Shiny應(yīng)用程序(http://scangeo.dartmouth.edu/ScanGEO/)進(jìn)行計(jì)算。

1.3 GPI相關(guān)基因及相關(guān)生物學(xué)功能分析 利用STRING在線軟件(https://string-db.org/)繪制GPI相關(guān)基因蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，納入條件為分子與分子間連接達(dá)到5個(gè)或5個(gè)以上的基因，從而獲得GPI高度相關(guān)基因，圖形輸出以SVG和PNG格式生成。GPI基因相關(guān)生物學(xué)功能分析采用在線網(wǎng)站Metascape(http://metascape.org/)的基因本體(GO)分析以及京都基因和基因組百科全書(KEGG)功能富集分析，篩選GPI基因可能參與并主要影響的生物學(xué)功能或通路。收集P<0.01、基因最小計(jì)數(shù)3個(gè)和富集因子>1.5的富集，選擇富集中具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的術(shù)語(yǔ)(P<0.05)作為該集合的富集結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 AD患者及健康老年人外周血、腦組織GPI基因表達(dá)變化 外周血芯片(GDS2601)分析結(jié)果顯示，健康老年人外周血GPI基因表達(dá)量在男性為4.08±0.25、女性為2.78±0.34，男性AD患者GPI基因表達(dá)量為3.60±0.45、女性為2.48±0.21；兩者女性外周血GPI基因表達(dá)量均低于男性(P均<0.05)；相同性別人群中，AD患者外周血GPI基因表達(dá)量低于健康老年人(P均<0.05)。腦組織芯片(GDS4758)分析結(jié)果顯示，AD患者海馬組織GPI基因表達(dá)明顯下調(diào)，低于額葉、顳葉皮質(zhì)(P均<0.05)，且在男性、女性中表現(xiàn)出相同趨勢(shì)。見表1。腦組織芯片(GDS810)分析結(jié)果顯示，正常老年人及輕、中、重度AD患者海馬組織GPI基因表達(dá)量分別為11.59±0.41、11.40±0.58、11.26±0.43、10.77±0.78，GPI基因表達(dá)量隨AD病情加重而持續(xù)減少(P均<0.05)。

表1 AD患者與健康老年人腦組織GPI基因表達(dá)量比較

注：與額葉、顳葉皮質(zhì)比較，*P<0.05。

2.2 GPI相關(guān)基因及生物學(xué)功能分析 通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共篩選出10個(gè)與GPI高度相關(guān)基因，分別為PKM、TPI1、PFKL、PKLR、PGM1、PFKP、ENO3、PFKM、H6PD、TKT。見圖1。GO分析及KEGG功能富集分析結(jié)果顯示，GPI基因與其相關(guān)10個(gè)基因在功能富集上與糖酵解、合成、分解、代謝等能量代謝過程高度相關(guān)。見圖2。提示GPI基因與其相關(guān)基因可能參與AD患者海馬腦區(qū)能量代謝的功能調(diào)控。

圖2 GPI基因功能富集分析結(jié)果

3 討論

目前，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和計(jì)算機(jī)技術(shù)已廣泛用于腫瘤研究的各個(gè)方面，但在AD相關(guān)研究中使用生物信息學(xué)分析的報(bào)道較少。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出3個(gè)適用于AD的芯片，共檢測(cè)了138個(gè)樣本，結(jié)果顯示，健康老年人中，女性外周血GPI基因表達(dá)量低于男性，且低于男性AD患者；相同性別人群中，AD患者外周血GPI基因表達(dá)量低于健康老年人。腦組織芯片分析結(jié)果顯示，AD患者海馬組織GPI基因表達(dá)明顯下調(diào)，低于額葉、顳葉皮質(zhì)，但與性別無(wú)關(guān)；GPI基因表達(dá)量隨AD病情加重而持續(xù)減少。上述結(jié)果提示，AD患者GPI基因表達(dá)下調(diào)不受性別影響，可以直接通過血液檢測(cè)觀察GPI基因表達(dá)變化；同時(shí)，GPI基因僅在腦部海馬區(qū)表達(dá)大幅下調(diào)，且隨AD病情惡化而表達(dá)減少，提示可以通過檢測(cè)GPI基因判斷AD并評(píng)估病情嚴(yán)重程度。由于GPI基因在外周血與海馬組織中的表達(dá)一致，而且GPI基因在其他腦區(qū)差異表達(dá)不明顯，故GPI基因可作為一個(gè)新的AD生物標(biāo)志物。由于無(wú)法在AD患者存活期采集到海馬區(qū)樣本，而血液樣本相對(duì)來(lái)說(shuō)容易獲得，因此有望通過檢測(cè)AD患者血液樣本GPI基因來(lái)輔助診斷AD。

大腦的能量消耗很高，需要使用全身約25%的葡萄糖來(lái)維持其能量消耗，其中大部分通過糖酵解和線粒體氧化磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)能量，這也是神經(jīng)、骨髓等組織細(xì)胞在有氧情況下獲得部分能量的有效方式[14]。葡萄糖代謝受損和線粒體功能異常是正常腦老化和AD早期階段的特征。有學(xué)者在腦老化和AD的動(dòng)物模型及晚期AD尸檢標(biāo)本中觀察到神經(jīng)炎癥，但對(duì)神經(jīng)炎癥是否為大腦衰老和AD的驅(qū)動(dòng)力仍存在爭(zhēng)議，目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)可能僅僅是衰老或AD早期發(fā)生能量代謝功能障礙的結(jié)果。近年來(lái)越來(lái)越多的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和人類樣本研究結(jié)果均顯示，能量代謝在氧化應(yīng)激和大腦炎癥反應(yīng)中具有重要作用。大腦代謝炎癥軸中能量代謝、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥相互影響，可能作為腦老化和AD病因的綜合機(jī)制。當(dāng)葡萄糖利用率和線粒體能量轉(zhuǎn)導(dǎo)能力下降，神經(jīng)元對(duì)葡萄糖的攝取減少，神經(jīng)元電子傳遞活性降低，氧化產(chǎn)物生成增多，最終導(dǎo)致一些神經(jīng)疾病的發(fā)生[15]。

GPI基因在海馬區(qū)表達(dá)特異性下調(diào)，提示AD的發(fā)生、發(fā)展與GPI基因功能異常有關(guān)。我們通過PPI網(wǎng)絡(luò)與功能富集分析探索GPI基因的相關(guān)基因和生物學(xué)功能，共篩選出10個(gè)與GPI高度相關(guān)基因，分別為PKM、TPI1、PFKL、PKLR、PGM1、PFKP、ENO3、PFKM、H6PD、TKT；GPI基因與其相關(guān)基因在功能富集上與糖酵解、合成、分解、代謝等能量代謝過程高度相關(guān)。PKM可以催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)移到ADP產(chǎn)生ATP的糖酵解酶。PFKL、PFKP、PFKM能通過ATP催化D-果糖6-磷酸磷酸化為果糖1,6-二磷酸(糖酵解的第一步)。同樣參與糖酵解過程的基因還有PKLR、PGM1、TPI1、ENO3，而且PKLR在糖酵解過程中具有關(guān)鍵作用。H6PD參與氧化葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖及其他己糖-6-磷酸。TKT可以通過與焦磷酸輔因子硫胺的共價(jià)中間體，催化二碳酮醇基團(tuán)從酮糖供體轉(zhuǎn)移到醛糖受體。這些基因皆與能量代謝密切相關(guān)。我們認(rèn)為，AD病程進(jìn)展與能量代謝功能障礙密不可分，而GPI基因可能是其中的關(guān)鍵基因。GPI主要作為糖酵解酶參與糖酵解過程，并能參與糖代謝、糖合成過程[16]。腦組織GPI基因表達(dá)異?？蓢?yán)重影響腦組織的正常功能[17]。最近有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，GPI基因及其受體表達(dá)增加可能會(huì)加強(qiáng)體內(nèi)學(xué)習(xí)和記憶形成的突觸機(jī)制[18]。但是GPI在AD發(fā)生、發(fā)展中的具體分子機(jī)制還有待更深入地研究。

綜上所述，AD患者外周血及海馬組織GPI基因表達(dá)下調(diào)，隨AD病情加重，其表達(dá)持續(xù)減少；GPI基因與其相關(guān)基因可能參與AD患者海馬腦區(qū)能量代謝的功能調(diào)控。繼續(xù)對(duì)GPI基因進(jìn)行更深入研究，有望為AD的基礎(chǔ)研究和臨床診治提供進(jìn)一步的理論指導(dǎo)。